HPLC法測(cè)定竹葉青酒專用梔子中藏紅花素-I的含量

李曉曉，吳成斌，任 杰，崔 帆，李艷艷

(山西杏花村汾酒廠股份有限公司，山西汾陽032205)

山西杏花村汾酒廠股份有限公司產(chǎn)的38%vol竹葉青酒是一款保健酒，它是在釀制過程中加入竹葉、梔子、陳皮、菊花、砂仁等12味中藥材精心配制而成，具有調(diào)節(jié)腸道菌群的保健功能。

梔子作為竹葉青酒配方中的一味主要原料，在竹葉青酒的制作過程中充當(dāng)著重要角色。梔子為茜草科植物梔子Gardenia jasminoidesEllis的干燥成熟果實(shí)，其性味苦，寒，歸心、肺、三焦經(jīng)，具有瀉火除煩，清熱利濕，涼血解毒之功效[1]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，梔子清熱瀉火的主要藥效成分為梔子苷等環(huán)烯醚萜類化合物，涼血解毒的功效成分主要是以藏紅花素和藏紅花酸為主的共軛多烯類化合物[2]。

《中國藥典》（2015年版）收錄有中藥材梔子，其中規(guī)定了梔子苷含量的測(cè)定方法，但沒有藏紅花素的含量測(cè)定指標(biāo)。本試驗(yàn)通過HPLC法對(duì)竹葉青酒配方梔子中藏紅花素含量的測(cè)定，一方面為中藥梔子的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供前期探索，另一方面為竹葉青酒的功效成分研究提供科學(xué)依據(jù)。藏紅花素是一類特殊的水溶性類胡蘿卜素，是梔子和藏紅花的主要成分之一。因梔子中的藏紅花素主要有藏紅花素-I、藏紅花素-Ⅱ、藏紅花素-Ⅲ、藏紅花素-Ⅳ，而其中主要的成分是藏紅花素-I，其他3種成分含量較低，因此，從理論上來講，以藏紅花素-I為對(duì)照品測(cè)定總藏紅花素含量的結(jié)果比以其他藏紅花素為對(duì)照品測(cè)定的含量結(jié)果相對(duì)更準(zhǔn)確、合理[3]。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

儀器與試劑見表1。

表1 儀器與試劑

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件（表2）

表2 色譜條件

1.2.2 對(duì)照品溶液的制備

用分析天平精密稱取藏紅花素-I標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，置于干燥的100 mL容量瓶中，使用體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇溶液定容，將其充分搖勻，配制成100 mg/L的藏紅花素-I標(biāo)準(zhǔn)液。用移液槍，精密吸取藏紅花素-I標(biāo)準(zhǔn)液0.25 mL、1.25 mL、2.5 mL、12.5 mL、18.75 mL、25 mL，并且分別都注入到一組25 mL的干燥的容量瓶中。再用體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇溶液定容，再次進(jìn)行充分搖勻。配制得到1 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、50 mg/L、75 mg/L、100 mg/L的藏紅花素-I標(biāo)準(zhǔn)液。

1.2.3 供試品溶液的制備

稱取100 g梔子粉末（60目），于1000 mL旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，加入70%vol乙醇600 mL，加熱至50℃，旋轉(zhuǎn)提取2 h，過濾后精密量取1 mL至25 mL的干燥的容量瓶中，以50%的甲醇溶液定容，搖勻，即得供試品溶液。

1.2.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取1.2.2中1 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、50 mg/L、75 mg/L、100 mg/L藏紅花素-I標(biāo)準(zhǔn)液各1 mL，在上述色譜條件下，直接注入色譜儀進(jìn)行分析，以藏紅花素-I色譜峰面積（Y）和溶液濃度（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1。

圖1 藏紅花素-I色譜峰面積與溶液濃度關(guān)系圖

結(jié)果表明，藏紅花素-I在1～100 mg/L范圍內(nèi)，峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y＝67208X+25234，R2=0.9998，說明兩個(gè)變量之間存在線性關(guān)系，可以作為本實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 精密度試驗(yàn)

精密吸取梔子供試品溶液，在上述色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，分別測(cè)定藏紅花素-I的峰面積，結(jié)果RSD為0.5%。

2.2 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取梔子6份各約10 g，精密稱定，按“1.2.3”操作，按上述色譜條件測(cè)定各樣品的峰面積，計(jì)算各對(duì)照品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，藏紅花素-I的RSD為1.21%。

2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取梔子供試品溶液，分別以0 h、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h在上述色譜條件下進(jìn)樣分析。分別計(jì)算藏紅花素-I的含量，RSD為0.9%，表明供試品在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 加樣回收率試驗(yàn)

精密量取按1.2.3方法配制的含藏紅花素-I的供試品溶液2 mL，6份，分別置于6個(gè)10 mL容量瓶中，然后分別加入按1.2.2方法配制的含藏紅花素-I的對(duì)照品溶液0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL，以50%的甲醇溶液定容至刻度線，在上述色譜條件下進(jìn)樣分析，計(jì)算回收率。藏紅花素的平均回收率為97.92%，RSD為0.58%。

2.5 樣品含量測(cè)定

精密稱取山梔子樣品3份，分別是樣品A、B、C，按照1.2.3供試品溶液的制備方法，測(cè)定其吸光度，計(jì)算含量。結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

3 結(jié)論

3.1 竹葉青酒專用梔子中藏紅花素-I的平均含量為0.594%，RSD為1.63%。該方法具有較好的線性關(guān)系，精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性和回收率都符合要求（RSD＜3%）。

3.2 各版藥典中都是以梔子苷含量作為梔子評(píng)價(jià)指標(biāo)，沒有對(duì)梔子中藏紅花素含量測(cè)定提出要求，但藏紅花素卻是梔子藥材中的主要活性成分之一，可以作為特征成分檢驗(yàn)的依據(jù)，同時(shí)為中藥梔子的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供前期探索。

3.3 藏紅花素中藏紅花素-I的含量最高。盡管藏紅花素-I的含量在不同產(chǎn)地梔子中差異較大，但藏紅花素-I占藏紅花素的百分比比較穩(wěn)定，大約為65%，而經(jīng)計(jì)算，其他幾種藏紅花素的百分比也相對(duì)穩(wěn)定。說明不同結(jié)構(gòu)藏紅花素的比例較穩(wěn)定，是梔子藥材化學(xué)成分的一個(gè)特征[4]。這說明利用高效液相色譜法雖能夠準(zhǔn)確測(cè)定梔子中藏紅花素-I的含量，卻無法反映藥材中含量較少的其他藏紅花素類衍生物。但由于藏紅花素-I占藏紅花素的百分比比較穩(wěn)定，因此，此測(cè)定方法可以為竹葉青酒功效成分研究提供科學(xué)依據(jù)。