高通量測序法對不同地域濃香型大曲微生物結構的分析

譚崇堯，徐 軍

（湖北枝江酒業股份有限公司，湖北枝江443200）

中國白酒歷史悠久，工藝獨特，是中華民族的瑰寶。中國白酒受氣候、土質、水質等自然因素以及歷史、文化、消費習慣等社會因素的影響，各地白酒更呈現不同的風格組成，在科技工作者及釀酒企業的共同努力下，中國白酒逐步形成和確立了醬香型、清香型、濃香型、米香型、鳳香型等十二大香型。濃香型大曲酒占全國白酒產銷量的70%，國家級名酒中濃香型約占50%。由于濃香型白酒市場大，生產廠家多，目前行業公認的濃香型白酒在風格上又劃分為北方派、江淮派和川派等。不同派別的濃香型白酒各有特點。2015年，喬曉梅[1]利用高通量測序技術分析了清香型白酒大曲中真菌群落結構。本文以濃香型白酒為研究對象，利用目前較為先進的高通量測序分析技術對不同地域的大曲真菌和細菌群落結構進行取樣分析，樣品來源于北方派、長江中游派、江淮派和川派等代表企業。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

樣品：來自北方派、長江中游派、江淮派和川派等代表企業大曲。

試劑：PBS緩沖溶液（pH7.0），無水乙醇，氯仿，10×TE Buffer，1%的瓊脂糖凝膠，Trans15k Marker，DL2000 DNA Marker，2×PCR Mix Buffer。

儀器設備：TG16-W微量高速離心機，PCR儀（ABI），凝膠成像儀，電泳槽，Miseq高通量測序平臺，美國Illumina公司。

1.2 試驗方法

大曲樣品的準備、大曲總DNA的提取、PCR擴增和高通量測序、文庫建立及數據分析見參考文獻[2]。

2 結果與分析

2.1 不同地域大曲真菌群落結構分析（圖1）

從圖1可以看出，長江中游地區和江淮地區的濃香型白酒大曲真菌主要為曲霉屬，數量占50%以上；北方地區和四川地區的白酒大曲差異較大，地域共性不如長江中游和江淮區域明顯，如川派的15號、17號和19號的優勢真菌為熱子囊菌屬和嗜熱真菌屬這類高溫菌，而16號和18號則為曲霉屬；而北方派主要呈現以酵母（異常維克漢姆酵母）和嗜熱高溫菌（熱子囊菌屬和嗜熱真菌屬）為主要優勢菌的差異。

圖1 不同地域濃香型白酒大曲真菌群落結構

2.2 不同地域大曲細菌群落結構分析（圖2）

圖2 不同地域濃香型白酒大曲細菌群落結構

不同地域濃香型大曲細菌群落結構分析如圖2，從圖2中可以看出，同為濃香型白酒大曲，微生物結構有其相同地方，但各企業大曲微生物構成均存在差異。濃香大曲中原核微生物主要為厚壁菌門，其中乳酸菌群為優勢菌，部分樣品還有高溫嗜熱菌、丙酸菌和Rheinheimera。

圖3 四川地區濃香型大曲細菌群落結構

2.2.1 川派大曲細菌群落結構分析

從屬分類水平上，四川地區5種大曲的主要微生物結構數量圖見圖3，熱圖見圖4。結果表明，樣品1的數量超過10%的細菌為檸檬酸菌屬（Citrobacter）、魏斯氏菌屬（Weissella）、葡萄酒菌屬（Staphylococcus)和丙酸菌屬（Propionibacterium），數量分別占15.7%、15.4%、12.1%和11.6%；樣品2的數量超過10%的細菌為丙酸菌屬、Rheinheimera和Desmospora3個菌屬，數量分別占20.46%、18.49%和12.0%；樣品3的數量超過10%的細菌為乳桿菌屬（Lactobacillus）、明串珠菌屬（Leuconostoc）和芽孢桿菌屬（Bacillus），數量分別占20.28%、10.59%和10.28%；樣品4的數量超過10%的細菌為Rheinheimera、乳桿菌屬和魏斯氏菌屬，數量分別占38.74%、14.26%和12.64%；樣品5的數量超過10%的細菌僅為高溫放線菌屬（Thermoactinomyces），數量占62.35%。

濃香型大曲的微生物組成復雜，主要來源于原料和生產環境，受制曲工藝影響，如制曲溫度。樣品5為典型的高溫曲，其中高溫放線菌屬數量超過60%，芽孢桿菌屬含量為7.77%，這兩種菌都為嗜熱微生物，能夠在溫度較高的制曲條件下生長、繁殖和代謝，其產生的酶在高溫條件下具有很高的活性和熱穩定性，是白酒特殊風味物質的重要來源之一。

數量超過10%的細菌在5個大曲中出現兩次的菌屬為乳桿菌屬、魏斯氏菌屬、丙酸菌屬和Rheinheimera；除此之外，含量較高的菌還有葡萄酒菌屬、明串珠菌屬、高溫放線菌屬、芽孢桿菌屬等。

圖4 四川地區濃香型大曲細菌群落熱圖分析

2.2.2 北方派大曲細菌群落結構分析

從屬分類水平上，北方地區5種大曲的細菌群落結構數量圖見圖5。結果表明，22號樣品的優勢菌為糖球菌和高溫放線菌，數量分別占53.7%和23.0%；24號樣品的優勢菌為葡萄球菌和真絲菌，數量分別占55.8%和22.8%；12號樣品的優勢菌為高溫放線菌和丙酸菌，數量分別占40.9%和27.3%；13號樣品的優勢菌為鏈孢子菌屬和丙酸菌屬，數量分別占42.7%和21.5%；14號樣品的優勢菌為魏斯氏菌屬、高溫放線菌屬和葡萄球菌屬，數量分別占27.2%、20.8%和14.4%。熱裸單胞菌屬、高溫放線菌屬、真絲菌屬、鏈孢子菌屬和芽孢桿菌屬都為嗜熱高溫菌，5個樣品的高溫菌數量分別占23.8%、23.1%、41.6%、43.5%和27.4%。因此，這些高溫菌為北方大曲的優勢菌屬，另有魏斯氏菌屬和丙酸菌。

2.2.3 江淮派大曲細菌群落結構分析

從屬分類水平上，江淮地區大曲的主要微生物結構數量圖見圖6。結果表明，10號樣品的優勢菌為乳球菌屬、芽孢桿菌屬、明串珠菌屬、魏斯氏菌屬、乳桿菌屬等，其中乳酸菌群數量占69.8%，芽孢桿菌屬占20.8%；1號樣品的優勢菌為乳桿菌屬、鏈孢子菌屬、魏斯氏菌屬、明串珠菌和片球菌，其中乳酸菌數量占63.4%，其次為鏈孢子菌屬，數量為22.6%。

圖5 北方地區濃香型大曲細菌群落結構

圖6 江淮地區濃香型大曲細菌群落結構

2.2.4 長江中游大曲細菌群落結構分析

長江中游地區大曲的主要微生物結構比例圖見圖7，如圖7所示，優勢菌為乳酸菌群。

圖7 長江中游地區濃香型大曲細菌群落結構

3 總結

濃香型白酒發酵過程中的微生物和酶主要來源于大曲，而微生物群落分布和生長與地域、氣候、環境條件等息息相關。本研究針對不同地區濃香型白酒大曲中微生物結構進行了系統的研究。綜上結果表明，濃香型酒曲中原核類微生物種類占總體69%，數量占總數31%。濃香大曲中原核微生物主要為厚壁菌門，其中乳酸菌群為優勢菌，部分樣品還有高溫嗜熱菌、丙酸菌和Rheinheimera。