窖泥中己酸菌的篩選及其運用

謝圣凱，陳建新

（江南大學生物工程學院糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇無錫214122）

濃香型白酒作為我國傳統香型白酒之一，其具有窖香濃郁、香味協調等風格，己酸乙酯已被確定為其主體風味物質[1]。己酸乙酯主要由己酸和乙醇反應生成，其中，己酸產自窖泥中的己酸菌[2]，而首株己酸菌Clostridium kluyveri于1937年由巴克爾發現，其主要產生己酸和丁酸，同時還生成少量乙酸，該菌被視為己酸菌的模式菌株。目前已報道的己酸菌多屬于專性厭氧的梭菌[3]，梭菌綱微生物分布較廣，也一直被認為是影響窖泥質量的重要功能菌群[1]。

鑒于己酸菌對濃香型白酒發酵的重要性，眾多學者對其展開研究。施安輝[4]從蘭陵美酒廠窖泥中分離出己酸菌C1，其己酸產量基本保持在1.8 g/L以上。吳衍庸等[5]從瀘州老窖窖泥中篩選出的瀘酒梭菌己酸產量為3.08 g/L。薛正楷[6]從萬賓酒業公司的百年窖池中篩選出的Clostridium celerecrescens菌株己酸產量為5.47 g/L。內蒙古輕工研究所分離到的己酸菌株內蒙古30#，其在35℃下培養10 d后的己酸產量達到7 g/L[7]。張彬等[8]報道的己酸菌S-20在神州八號飛船太空育種后，培養10 d的己酸產量為4.55 g/L。由此可見，窖泥中存在的多種己酸菌因其多樣化的代謝產物從而具有較強的應用價值。

己酸菌廣泛用于人工窖泥培養。姚萬春等[9]以黃泥為載體培養的人工窖泥己酸菌數量為9.03×106cfu/g；天府酒業人工窖泥中己酸菌數量為5.4×105cfu/g[10]。

另外，鑒于濃香型白酒是在窖池中釀造，而窖池具有占地面積大、不利于控溫發酵等缺點，目前已有一些酒廠采用生物反應器釀造濃香型白酒[11]。但是，窖泥以貼壁形式在反應器中使用，具有影響傳熱的問題；且黃泥載體窖泥黏附性強，不易取出，故需要培養出新型載體窖泥以適應生物反應器[12]。

本研究采用厭氧法從窖泥中分離高產己酸菌，并從pH值、乙醇耐受性、揮發性物質含量等方面研究其生理生化性質，另外結合16S rRNA性質分析其系統發育學地位。之后將本研究篩選的高產己酸菌作為己酸菌來源培養多種載體的人工窖泥，并搭配酒醅進行厭氧發酵以評估窖泥發酵性能，從而為濃香型白酒發酵及其生物反應器釀造提供優質菌株資源和適宜的窖泥。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗原料

窖泥a由某濃香型酒廠提供。

1.1.2 菌株來源

Clostridium guangxiensestrain xsk1和Clostridium kogasensisstrain xsk2均分離自窖泥a。

1.1.3 培養基

己酸菌分離與培養采用RCM培養基和ES培養基[1]。

1.2 儀器與試劑

氣相色譜儀（GC2010），日本島津公司；生化培養箱（BSP-250），上海博訊實業有限公司；厭氧產氣袋、厭氧培養袋，日本三菱公司。

甲酸、己酸（色譜純），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；2-乙基丁酸（色譜純），梯希愛（上海）化成工業發展有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 己酸菌篩選[13]

把窖泥放入裝有RCM液體培養基、裝液量約90%的50 mL三角瓶中后，以80℃加熱10 min，冷卻后添加2%的無水乙醇，連同未涂布的RCM、ES固體平板快速放入厭氧培養袋中（內有氧氣指示劑和厭氧產氣袋，厭氧產氣袋在耗盡氧氣的同時會產生CO2），于37 ℃下培養4 d后，吸取200 μL窖泥培養液涂布RCM、ES固體平板，放入厭氧培養袋中，37℃培養至菌落長出，挑選平板上長出的單菌落在RCM平板上劃線。

1.3.2 菌種鑒定

（1）基因組提取參考熊君燕的方法[14]。（2）PCR擴增，反應體系為 10×PCR buffer(Mg2+)5 μL，dNTP(2.5 mM）4 μL，DNA模板1 μL，10 μM 正反向引物（27F、1492R）各 3 μL，rTaq 酶(5 U/μL)：0.5 μL，ddH2O：33.5 μL。反應程序如下：預變性：94 ℃ 5 min；變性：94 ℃ 30 s；退火：56 ℃30 s；延伸：72℃ 1 min 30 s；后延伸：72℃ 10 min；循環數為30。PCR擴增純化后進行測序，測序結果在NCBI中進行比對，上傳序列后獲取菌株登錄號。

1.3.3 系統發育分析

將分離出的兩株己酸菌16S rRNA序列與其親緣關系最近的相關菌株的16S rRNA序列利用MEGA7軟件中Clustal W功能進行比對。然后用Construct/Test Neighbor-Joining Tree方法構建系統發育樹，數據進行1000次自展重抽樣以確定各分支的準確性[1]。

1.3.4 揮發性物質采用氣相色譜測定

液體樣品處理：將5 mL樣品在8000 r/min下離心10 min，通過濾膜后吸取562.5 μL濾液添加到含有31.5 μL 2-乙基丁酸[15]（184.8 g/L）、31.5 μL乙酸正戊酯（175.2 g/L）的25 mL容量瓶中，并用體積分數為1.5%[16]的甲酸溶液定容，混合均勻后吸取1 μL進行氣相色譜測定。固體樣品處理[17]：使用40 mL 60%乙醇溶液超聲浸提5 g固體樣1 h，將浸提液在8000 r/min下離心10 min，其余步驟同液體樣品。

GC檢測條件[16]：檢測器：氫火焰離子化檢測器；色譜柱：CB-FFAP（30 m×0.50 μm×0.32 mm）；溫度程序：60℃保持5min，以25℃/min升至210℃，保持6 min；進樣口溫度為230℃；分流比：20∶1；檢測器溫度230 ℃。

1.3.5 己酸菌計數[14]

液體樣品計數：取1 mL樣品與9 mL無菌生理鹽水混合，混勻后進行梯度稀釋，選取稀釋液涂布RCM平板，放入厭氧培養袋中于37℃進行培養。固體樣品計數：取10 g樣品于裝有90 mL無菌生理鹽水的三角瓶中，低溫振蕩10 min，吸取1 mL樣液與9 mL無菌生理鹽水混合，其余操作與液體樣品相同。

1.3.6 兩株己酸菌培養實驗

分別將150 μL的菌株Clostridium guangxiensestrain xsk1和Clostridium kogasensisstrain xsk2接種到裝液量約90%[18]的RCM培養基中，培養適量時間后分別吸取150 μL菌液接種到相應培養條件的三角瓶中，快速放入厭氧培養袋中于37℃培養，培養結束后分別進行揮發性成分檢測和己酸菌計數。

1.3.7 人工窖泥培養工藝流程[9]

己酸菌菌株→放大培養→添加窖泥種子、黃水、乙醇、大曲→復合功能菌液→加入黃泥等窖泥載體、窖泥種子、大曲、豆餅粉、乙醇、麩皮、乙酸鈉、磷酸氫二鉀、黃水、干酒糟、水→混合均勻→37℃下密封發酵60 d。

1.3.8 窖泥性能測定

實驗室模擬發酵采用單糧發酵，其中，糧醅比為1∶4.5，糧曲比為3∶1，糧水比為1∶0.9，糧食∶稻殼為4.6∶1。將窖泥用人工窖泥袋包好后放在容器底部，添加一定比例的混蒸后加曲的酒醅，封口后快速放入厭氧培養袋中于37℃下培養50 d，之后取樣檢測酒醅中己酸、己酸乙酯等物質含量，以此評估窖泥性能。

2 結果與分析

2.1 己酸菌的篩選

2.1.1 己酸菌的篩選與鑒定

采用ES和RCM兩種培養基分別篩選己酸菌，實驗發現，涂布培養8 d后的ES固體平板無菌落長出，而RCM固體平板表面和底部皆有菌落長出。經過篩選純化、分離鑒定和NCBI比對，使用RCM培養基從窖泥中篩選得到2株己酸菌見表1。

表1 窖泥中己酸菌的分離結果

2.1.2 菌株的形態

上述2株己酸菌的菌落和顯微鏡結構圖見圖1，兩株己酸菌的菌落形態皆呈現凸起、白色、近圓形、光滑、質地均勻易挑起特征，顯微形態上皆表現為桿狀。

圖1 己酸菌在培養基上菌落及微觀形態比較

2.1.3 菌株厭氧性實驗（表2）

由表2可知，此兩株己酸菌皆屬于嚴格厭氧菌，這符合梭菌綱細菌屬于嚴格厭氧的芽孢桿菌類微生物的觀點。

2.1.4 不同pH值培養條件下兩株己酸菌培養液揮發性物質變化（圖2）

表2 己酸菌株厭氧特征

圖2 Clostridium guangxiense strain xsk1（a）、Clostridium kogasensis strain xsk2（b）發酵液中揮發性成分

由圖2可知，Clostridium guangxiensestrain xsk1菌株在不同pH值條件下培養菌液中揮發性物質含量存在差異，其中，對比有機酸含量可知，己酸＜丁酸＜乙酸，這印證了丁酸、乙酸是合成己酸的前體物質的觀點[19]，但是這也說明己酸菌在產酸方面可能并不是己酸含量最高。另外，在pH6時己酸、乙酸和丁酸含量皆處于最高，初步得出pH6較為適合該菌生長，這符合己酸菌更喜歡在中性偏酸性環境下繁殖的觀點[18]。另外，其菌液中有檢測到己酸乙酯和丁酸乙酯，而丁酸乙酯、己酸乙酯、己酸、丁酸是濃香型白酒中重要的風味物質，這與胡曉龍篩選出的Clostridium kluyveriN6己酸菌液揮發性物質較為類似[1]。

同理，觀察圖2可知，Clostridium kogasensisstrain xsk2菌株在pH6時，菌液中己酸含量相比其他pH值條件下更高，且此時乙酸、丁酸含量也處于最高水平，說明該菌株在pH6條件下適宜生存。另外，此菌株菌液中也檢測出丁酸乙酯和己酸乙酯，說明其對濃香型白酒風味物質的形成起到促進作用。

綜上所述，上述兩株己酸菌皆適宜在pH6條件下生長。

2.1.5 兩株己酸菌株乙醇耐受性實驗（圖3）

由圖3可知，在不添加乙醇時，Clostridium guangxiensestrain xsk1菌液中己酸含量相比添加乙醇己酸含量更高，這說明其在不含乙醇的環境下也可生長良好，從而證明了梭菌可利用底物的多樣性，同時，丁酸和乙酸含量也呈現出類似現象，這與己酸的產生機制較為吻合[19]。另外，不添加乙醇與添加1%乙醇培養的菌液中己酸含量較為接近，這說明1%含量乙醇可能并未對該菌株產生較強脅迫，而適量乙醇也可為該己酸菌提供碳源物質[19]。值得注意的是，隨著乙醇含量的增大，菌液中己酸、乙酸、丁酸含量皆逐漸降低，當乙醇含量增加到7%時，菌液中有機酸含量幾乎不再變化，結合表3可知，這可能與該菌株在7%乙醇條件下培養4 d后幾乎全部死亡有關。

Clostridium kogasensisstrain xsk2菌株在1%乙醇含量時己酸、乙酸和丁酸高于其他乙醇含量條件下菌液有機酸含量，可見1%乙醇含量為其適宜生長條件。結合表3可知，不添加乙醇時菌液中己酸菌數量高于添加1%乙醇時的菌液，而前者己酸含量卻低于后者，這可能是己酸、丁酸含量過高抑制了己酸菌的生長[20]。

圖3 Clostridium guangxiense strain xsk1（a）、Clostridium kogasensis strain xsk2（b）在不同乙醇含量下發酵液中揮發性成分變化

表3 不同乙醇添加量菌液中己酸菌數量

圖4 兩株己酸菌的16S rRNA基因序列的系統發育樹

綜上所述，可知兩株己酸菌的乙醇耐受范圍基本處于0%～5%之間。

2.1.6 兩株己酸菌生理生化特征總結

如表4所示，兩株己酸菌在許多性質上較為相似，這可能與其在窖池中經過長期馴化有關。

表4 兩株己酸菌生理生化特性

表5 人工窖泥己酸菌數量檢測結果

2.1.7 兩株己酸菌系統發育分析

由圖4可知，從窖泥a中篩選出的兩株己酸菌分布于梭菌屬，其與Clostridium kluyveri菌株遺傳學地位相對較遠，說明了己酸菌具有豐富的遺傳多樣性[21]。

2.2 己酸菌Clostridium guangxiense strain xsk1在人工窖泥培養中的運用

2.2.1 不同載體人工窖泥的培養

由表5可知，不同載體人工窖泥中己酸菌數量差異顯著，其中，粉末活性炭載體人工窖泥＞黃泥、粉末活性炭和顆粒活性炭載體人工窖泥＞黃泥、粉末活性炭載體人工窖泥＞黃泥載體人工窖泥，而唯有粉末活性炭載體人工窖泥中的己酸菌數量超過窖泥a。雖然各載體人工窖泥己酸菌數量高低不同，但是仍需要進一步評估其發酵效果。

2.2.2 各載體人工窖泥的發酵性能

由圖5可知，初始酒醅己酸含量幾乎為零，厭氧發酵50 d后，各種窖泥發酵的酒醅中己酸含量幾乎都高于不添加窖泥發酵的酒醅，這說明窖泥對于己酸的形成具有促進作用。按照5%比例添加的窖泥a發酵的酒醅己酸含量與不加窖泥發酵的酒醅較為接近，但是其明顯低于按照10%、15%比例添加的窖泥a發酵的酒醅，且按照10%比例添加的窖泥a發酵的酒醅己酸含量略高于15%比例添加的窖泥a發酵的酒醅，這說明適量的窖泥搭配酒醅發酵效果可能會更好，而添加不同比例的黃泥載體人工窖泥的發酵酒醅的結果也證明了這點。另外，按5%、10%、15%比例添加的粉末活性炭載體人工窖泥發酵的酒醅，其己酸含量要略高或者顯著高于其他3種載體的人工窖泥發酵的酒醅，但是，其更為接近窖泥a發酵酒醅的己酸含量。

對比酒醅中己酸乙酯含量可知，初始酒醅中己酸乙酯含量幾乎為零，窖泥a發酵的酒醅己酸乙酯含量顯著高于不添加窖泥的酒醅，且其明顯高于其他各載體人工窖泥發酵的酒醅。其中，粉末活性炭載體人工窖泥發酵的酒醅己酸乙酯含量最為接近窖泥a發酵的酒醅。另外，可能由于酒醅發酵是在厭氧袋中進行的，過早的厭氧環境導致了酵母菌死亡過多，造成酒精產量較低，最終導致各載體人工窖泥相比不加窖泥發酵的酒醅己酸乙酯含量差異不大。

對比酒醅中乙酸含量可知，除去窖泥a，其他4種載體人工窖泥按照5%、10%比例發酵的酒醅中乙酸含量相差不大，且都顯著低于按照15%比例添加的相應載體窖泥發酵的酒醅。而上述4種人工窖泥按照15%比例發酵的酒醅中乙酸含量與窖泥a按照10%、15%比例發酵的酒醅相差不大，但都顯著高于不加窖泥發酵的酒醅。

對比酒醅中丁酸含量可知，隨著培養時間的延長，酒醅中丁酸含量一般都高于發酵初始酒醅，其中15%比例添加的窖泥發酵的酒醅中丁酸含量一般都不低于5%、10%比例添加的窖泥發酵的酒醅，而且各載體人工窖泥發酵的酒醅與窖泥a發酵的酒醅丁酸含量相差不大。

綜上所述，發現粉末活性炭載體人工窖泥的發酵性能更為接近窖泥a，考慮到其具有靈活的形狀可塑性，在生物反應器中使用時容易取出，因此選定其作為適合生物反應器使用的新型窖泥。

圖5 酒醅中揮發性物質含量

3 結論

己酸菌作為窖泥中的功能菌，其對合成己酸乙酯具有重要作用。本研究采用厭氧培養袋方法從窖泥中分離出兩株己酸菌：Clostridium guangxiensestrain xsk1和Clostridium kogasensisstrain xsk2，菌株較適生長條件皆是pH6，乙醇耐受范圍皆處于0%～5%之間。其厭氧培養10 d后，前者代謝產物為：己酸4.51 g/L、丁酸7.07 g/L、乙酸7.47 g/L、丁酸乙酯0.20 g/L、己酸乙酯0.13 g/L；后者代謝產物為：己酸2.5 g/L、丁酸1.6 g/L、乙酸2.36 g/L、丁酸乙酯0.09 g/L、己酸乙酯0.36 g/L，由此可見，上述兩株己酸菌在濃香型白酒發酵上可能具有良好的運用前景[22]。另外，根據16S rRNA分析，上述兩株己酸菌與模式菌株Clostridium kluyveri在遺傳學性質上有顯著不同，而且這兩株己酸菌在發育地位上也相隔較遠，從而說明己酸菌可能具有豐富的遺傳多樣性。

將高產己酸的Clostridium guangxiensestrain xsk1菌株作為己酸菌來源培養多種載體的人工窖泥，結果發現，培養60 d后的粉末活性炭載體人工窖泥中己酸菌數量為1.77×108cfu/g，黃泥載體人工窖泥己酸菌數量為1.18×105cfu/g，黃泥、粉末活性炭載體人工窖泥己酸菌數量為3.68×105cfu/g，黃泥、粉末活性炭和顆粒活性炭載體人工窖泥己酸菌數量達到2.08×106cfu/g。其中，粉末活性炭載體人工窖泥己酸菌數量高于窖泥a。之后，對比上述各載體人工窖泥和窖泥a的發酵效果發現，粉末活性炭載體人工窖泥發酵性能較為接近窖泥a。

綜上所述，鑒于窖泥中微生物眾多，本文只專注于窖泥中的己酸菌方面，這具有一定的局限性；而且，發酵后的酒醅中揮發性成分眾多，而本文只檢測少許物質，因此在后續實驗中仍需要采用精密的檢測儀器進一步完善。