LPS局部骨溶解模型在骨外科學的應用分析

項錫勇　黃浩　宋方茗

摘要：本文選用小鼠LPS骨溶解模型探索骨外科手術模擬操作的可行性。實驗證明LPS骨溶解模型能夠較真實地模擬人類骨關節炎情況，可利用頭顱注射法，達到LPS骨溶解模型的建立，采用雙蒸水制備LPS溶液，最后在HE及TRAP染色的條件下，利用儀器來進行骨溶解的觀察及計算破骨細胞計數及TRAP數量和骨陷窩變化。采用小鼠LPS骨溶解模型進行骨關節炎模擬的臨床前教學，可以提高學生對骨關節炎發生機制和治療體系的理解，強化學習效果，值得在醫學本科生教學和各層次骨學繼續教育學習班操作課程中進一步推廣。

關鍵詞：LPS；局部骨溶解模型；破骨細胞；TRAP；骨陷窩；臨床前教學

中圖分類號：G642.0 文獻標志碼：A 文章編號：1674-9324（2018）44-0214-02

一、前言

隨著時代的發展，人們的生活水平不斷改善和提高，生活方式也隨之改變，但骨關節病的患病率卻在逐年增加，因而對于骨關節病的治療人們也開發了許多方法，其中人工關節置換術是最能有效治療晚期骨關節病和恢復關節功能的一種有效方法，也是目前臨床上治療晚期骨關節病的重要方法。但該種方法也存在著許多問題從而導致手術的失敗，例如無菌性松動和假體周圍骨溶解這兩種因素。有研究發現在UHMWPE導致的骨溶解的鼠模型中有內毒素的積聚現象，其主要成分是LPS，因此骨溶解及骨吸收等可能與LPS密切相關。炎癥性骨疾病中骨生長重建規律尚不明確，而通過研究LPS介導下炎癥性骨疾病中破骨細胞的分化和活性調控機制，對于明確其規律起重大作用，同時也能為感染性骨疾病的治療提供新方向。

人工關節置換從設計—應用—改進—再應用經歷了近百年的發展，已經成為治療關節疾病的標準手術之一。在發達國家，人工關節置換術已經成為對嚴重的髖、膝關節病變施行外科重建的常規手術方法，它的目的是解決關節的疼痛問題、改善關節使其運動功能得到恢復以及矯正關節畸形。雖然人工關節置換術后關節活動較好，可早期下地活動，能減少老年患者長期臥床等，但術后仍可發生假體磨損、假體無菌性松動、假體周圍骨折骨關節置換等狀況，假體磨損或假體顆粒或假體有細菌殘留，容易導致炎癥，從而導致骨破壞，最終手術失敗，讓患者再次經歷二次手術。[1]骨髓炎、內置物手術后感染易引起持久性炎癥反應，不僅損害病人身心健康，而且給病人經濟帶來負擔。據統計假體術后感染并發癥的醫療支出人均約50000美元，全美每年達2500億美元。[2]人工關節的無菌性松動是影響關節置換術后遠期療效的主要因素。在無菌性松動的假體周圍可以看見骨質有明顯的溶解現象，使其支撐結構破壞，致使假體松動。[3]近年來，越來越多的臨床實踐表明，脂多糖可黏附多種人工假體材料并刺激細胞產生多種溶骨性因子，從而促進骨溶解。為了適應時代發展趨勢，為骨關節手術教學提供更多、更具有實用性的教學研究平臺，我們對通過建立C57小鼠局部骨溶解模型模擬LPS誘導骨溶解進行了嘗試和評價。

二、教學方法

1.LPS溶液制備：實驗采用雙蒸水配制成濃度為2g/L的LPS溶液，過濾除菌，-20℃保存；臨用前用雙蒸水溶液分別稀釋1.75g/L、1.5g/L、1g/L、500mg/L、250mg/L。

2.體內骨溶解模型的制作：取生理狀態基本相同的C57小鼠30只，其中5只作為空白對照，其余25只隨機分為五組實驗組1、2、3、4、5，分別定期（共計四次，隔天注射，即第一天、第三天、第五天、第七天）顱蓋骨骨膜注射濃度為1.75g/L、1.5g/L、1g/L、500mg/L、250mg/L的LPS溶液100μL。術后即第八天頸椎脫臼處死小鼠，取出完整顱蓋骨進行常規組織石蠟。

3.切片、HE及TRAP染色，顯微鏡下觀察軟骨組織學特征。[4]

4.骨溶解的觀察及計算：組織蠟塊用德國LeicaRM2135切片機切片，連續三層切片，層厚3.5μm。行常規HE染色，10×、20×及40×條件下觀察，40×條件下攝像。圖像用Maticimages2.0軟件處理，計算正中矢狀線區域骨吸收溶解面積，結果用均數±標準差表示。[5]

5.破骨細胞計數及TRAP數量和骨陷窩變化：抗酒石酸酸性磷酸酶染色（TRAP）是破骨細胞的特異性染色[6]。組織蠟塊用德國LeicaRM2135切片機切片，連續三層切片，層厚3.5μm。按說明書操作，將切片浸泡，避光37℃溫箱溫育90分，著色完全后移去反應液，脫水干燥后明膠封。Olympus電子顯微鏡20×、40×及100×條件下觀察，10×條件下攝像計算正中矢狀線區域的TRAP+細胞數量，結果用均數±標準差表示。觀察每個細胞中骨陷窩大小、數量、深度。

三、預期結果

1.實驗組與對照組相比，對照組中的基本沒有骨溶解現象，實驗組在圖像中可明顯觀察到骨溶解的面積。而在電子顯微鏡觀察下的切片中可清晰地看到實驗組的破骨細胞、TRAP數量明顯多于對照組，并且骨陷窩深度更深、面積更大、數目更多。

2.在五組實驗組中，隨著LPS溶液濃度的增大，骨溶解現象更加明顯，具體表現在骨溶解面積變大，破骨細胞、TRAP數量增多，以及骨陷窩深度更深、面積更大、數目更多。

四、討論

對全科醫師骨關節炎治療技術繼續教育課程或是醫學本科生教學來說，怎樣讓學員獲得更多有關基礎骨外科手術操作的親身真實體會，將得到的實踐感知與理論知識結合，保正將所學的醫學技術適當、精確地運用到臨床手術中，最后為患者帶來真正有效的治療，一直都是醫學教育工作者探討的熱點問題。所以在醫學本科生教學或骨科學繼續教育學習班課程中，對學生進行有效的骨溶解模型臨床前培訓就顯得十分重要。

根據以往所采用的教學方式而言，例如動畫模擬、臨床實踐見習和塑料橡膠模型等方式，就其結果所反映效益來說，以動物模型標本為對象的骨關節手術臨床前模擬操作方式最能讓學生學到有用知識，最大限度符合教學預期效果。值得一提的是，此類教學方式與許多專家學者所主張的“在沒有真實病人的情況下為學員提供一個真實模擬環境以及反復練習新技術的機會”思想不謀而合。而在我們的實驗中，所采用小鼠局部骨溶解模型方法就能夠較真實地模擬人類骨關節組織情況，猶如在真人骨關節中一樣，便于學生與老師實施各類基礎骨關節手術操作練習及展示，不僅實踐感覺真實和視野清楚，更能給骨外科病學繼續教育學習班課程學習或醫學本科生教學提供了良好的基礎骨關節手術臨床前教學平臺，值得全方位地推廣和使用。

參考文獻：

[1]段鋼，朱自強.脂多糖對人工關節磨屑誘導的骨溶解的影響[J].徐州醫學院學報，2008，28（4）：242-244.

[2]范衛民，王青，陶松年，等.腫瘤壞死因子與人工關節無菌性松動關系的探討[J].南京醫科大學學報，2000，20（2）：117-118.

[3]周景輝，吳耀持，李石勝，朱偉民，張圣宏.鼠類膝骨關節炎模型的評價[J].中國組織工程研究與臨床康復，2010，14（33）：6206-6209.

[4]王婧，張忠輝.大鼠關節炎三種動物模型的建立和比較[J].中國細胞生物學學報，2010，32（3）：456-460.

[5]張亮，陳志榮.一種磨損顆粒誘導的骨溶解模型的制作[A].寧夏醫學雜志，2008，30（4）：298-299.

[6]朱彤，劉勇章，胡小鵬.家兔膝關節骨關節炎動物模型的建立[J].醫學臨床研究，2006，23（8）：1188-1190.

Abstract：The feasibility of using LPS osteolysis model to explore the operation of bone surgery was studied. Experiment proved that LPS bone dissolve model can simulate a real human osteoarthritis，head shots，available to dissolve the LPS bone model，adopt double LPS solution，and finally in the steaming water preparation HE stain and TRAP conditions，using the instrument for bone dissolve observation and calculation，broken bone cell count and number of the TRAP and the bone pit changes. The osteoarthritis LPS in mice bone dissolve model simulation of preclinical teaching，and can improve students' understanding of osteoarthritis occurred mechanism and treatment system，strengthen the study effect，is worth in the medical undergraduate teaching and at all levels continue to education to accelerate the operation course of further promotion

Key words：LPS；partial osteolysis model；osteoclasts；the TRAP；the bone pit；preclinical teaching