P16在宮頸上皮內瘤變Ⅱ級組織中的表達及臨床意義

張 媛 ，賀桂芳 ，馬 莉 ，趙婷婷 ，卞美璐 ，原亞莉 ，楊文艷

（1.北京大學 醫學部，北京 100191；2.北京大學 中日友好臨床醫學院，北京 100029；3.中日友好醫院 婦產科，北京 100029；4.中日友好臨床研究所 “免疫炎性疾病”北京市重點實驗室，北京 100029）

宮頸癌發病率在全球女性腫瘤中位居第三位，在發展中國家位居第二位[1，2]。根據世界衛生組織（world health organization，WHO）估算，全球每年約53萬女性發生宮頸癌，約27.5萬女性死于宮頸癌。宮頸癌在多數發展中國家，占女性腫瘤死因的第一位[3]。我國宮頸癌每年新發病例約為9.6萬例，占世界宮頸癌每年新發病例的18%，其中死亡病例約2.6萬[4]。在基線為CINⅠ的患者，p16INK4a陽性與陰性婦女相比，2年后進展為高級別子宮頸病變的風險前者是后者8.25倍，表明p16INK4a的過度表達與宮頸病變程度相關，低級別宮頸病變組織中p16INK4a過度表達能夠對其以后進展為高級別宮頸病變具有預測能力[5]。對于CINⅡ具有進展和退化的生物學行為，目前我國尚缺乏確切的方法判斷其預后轉歸。本研究采用免疫組織化學法檢測P16表達情況，分析P16蛋白表達與CINⅡ病變進展的關系，為臨床采用合理的干預措施提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料來源

選取2008年1月～2017年12月就診于中日友好醫院，經術后病理報告確診為宮頸上皮內瘤變（CINⅡ）患者的石蠟組織切片158例。正常宮頸石蠟組織切片40例。患者組織的病理診斷均經2位有經驗的病理科醫師確診。

1.2 試劑

抗P16（E6H4）鼠單克隆抗體試劑、新型酶標記物IgG聚合物（上海羅氏制藥有限公司）。二氮基聯苯胺（DAB）顯色試劑（福州邁新生物技術開發有限公司）。采用Tris-HCl緩沖液來稀釋抗P16（E6H4）鼠單克隆抗體試劑。在此產品中沒有發現已知的非特異性抗體反應性。

1.3 檢測方法

利用免疫組織化學方法進行染色。結果判定：P16INK4A的免疫組織化學判定方法主要有兩個方面：表達強度和細胞中表達部位。陽性結果為黃色或棕黃色染色，表達部位是在胞漿和/或細胞核。表達強度參照KLEASR等[6]的半定量標準，按照陽性細胞核所占比例及分布情況記錄如下：陰性（-）：單個細胞染色，陽性細胞數＜5%；弱陽性（+）：散在的或小的細胞團染色，陽性細胞數為5%-24%；陽性（++）：片狀或簇狀細胞染色，陽性細胞數位25%-50%；強陽性：彌漫散的細胞染色，陽性細胞數＞50%。

HPV檢測：采用免疫組化技術法，通過發光放大微孔板中基因信號，對受檢標本中HPV18，33，45等13種高危型HPV病毒進行檢測。檢測結果陰性：HPV-DNA負荷量＜1.0pg/ml；陽性：HPV-DNA負荷量≥1.0pg/ml；其中HPVDNA負荷量=標本相對發光單位/標本陽性對照。

LCT檢測：清潔宮頸表面黏液，將特制的宮頸細胞刷插入宮頸管內，順時針在宮頸內旋轉5周后快速取出，注入細胞保存液中獲取細胞樣品，采用TBS系統檢測液基細胞。檢測結果陽性：ASCH、AGUS/ASCUS、HSIL、LSIL 出現異常或病變。

1.4 統計學方法

所有數據應用SPSS20.0軟件包進行統計分析，相關性分析比較患者的術后隨訪細胞學結果和P16的表達關系，再用秩和檢驗來比較各組間的差異。

2 結果

2.1 宮頸標本中P16生物標記物表達情況

宮頸標本中P16生物標記物過度表達表現為宮頸鱗狀上皮的基底層和基底旁層細胞的彌漫性連續性染色、伴有或不伴有淺表細胞層細胞染色，呈淡黃色至棕褐色，表達強度逐漸增強（見圖1，封底）。

圖1 A.CINⅡ患者P16陽性表達。B.CINⅡ患者P16陰性表達。（100×）

2.2 P16在正常組織與CINⅡ中陽性表達

對40例正常宮頸組織和158例術后病理確診為CINⅡ患者的石蠟切片利用免疫組化原理進行染色，觀察P16表達情況并進行統計分析。表1示，CINⅡ患者宮頸組織中P16陽性表達率為55.7%，顯著高于正常宮頸組織中P16陽性表達率（7.5%，P＜0.01）。

2.3 P16陽性表達與HPV感染的關系

對158例CINⅡ患者中進行HPV感染與P16陽性表達關系的統計分析。隨機挑選22例P16陰性的患者中HPV陰性表達為18例，陰性表達率為82%；HPV陽性表達為4例，陽性率18%。隨機挑選40例P16陽性表達CINⅡ患者中進行HPV感染的統計。HPV陰性表達為10例，陰性表達率為25%；HPV陽性表達30例，陽性率75%。P16陽性表達與HPV陽性和陰性比較,差異有統計學意義（P＜0.05）（見表 2）。

2.4 CINⅡ患者陽性表達術后隨訪結果

表3示，在CINⅡ患者中隨機選取37例進行術后隨訪，P16陽性患者超薄細胞檢測（LCT）陽性率72.72%，顯著高于P16陰性患者的LCT陽性率（15.79%，P＜0.05）。

表1 P16在正常組織與CINⅡ中陽性表達的統計結果 n（%）

表2 P16陽性表達與HPV感染的關系 n（%）

表3 CINⅡ患者P16陽性表達術后隨訪結果 n（%）

3 討論

p16基因是一個多腫瘤抑制基因，主要作用在于能夠直接參與細胞周期的調節，抑制細胞周期素依賴性蛋白激酶CDK4／CDK6的活性，阻止細胞從G1期進入s期[7]。p16基因的失活將導致細胞周期失控，細胞異常增殖而癌變。該基因產物對CDK4的活性具有抑制作用，因而也稱為p16 INK4（inhibitor of CDK4）[8]。 P16 的高表達與宮頸癌有一定的相關性，在組織病理學中這一結論已經得到證實[9]。因此P16免疫組化染色已被應用于宮頸癌前病變的輔助診斷，以提高診斷的準確率和可重復性。

有關報道指出，P16在正常組織中表達率為2%，在CIN1中表達率為38%，在CIN2中表達率為68%，在CIN3中表達率為82%[10]。因此P16可以作為宮頸癌上皮內瘤變的一個有效的分子指標。本研究中，P16在正常宮頸組織中陽性率為7.5%；在CINⅡ患者中陽性率為55.7%。P16在正常組織和CINⅡ患者中陽性表達情況具有統計學意義 （P<0.05）。進一步證實了CINⅡ患者中P16表達呈顯著正相關，說明P16的高表達促進了宮頸病變的進展。

1977年ZurHausen發現宮頸癌發生的一個重要原因是HPV感染，研究表明由于HR-HPV的E7癌蛋白介導的視網膜母細胞瘤蛋白失活，P16蛋白強烈過度表達[11]。由于E7是HPV相關癌前病變和癌變中維持惡性表型的必要因素，因此P16過度表達與HR-HPV的致癌活性直接相關，并被認為是HPV感染轉化的標記物。本研究中P16陽性表達CINⅡ患者中HPV陽性率為75%，陰性率為25%。P16陽性表達與HPV是否感染，兩者差異比較有統計學意義（P<0.05），進一步證實了P16過度表達與HPV感染的致病有直接關系。

Roelens等對p16INK4a免疫細胞化學染色與人乳頭瘤病毒基因檢測HC-Ⅱ對ASCUS和LSIL的分流能力做了薈萃分析，結果發現，p16INK4a預測ASCUS和LSIL進展為高級別子宮頸病變的敏感度分別為83.2%、83.8%，特異度分別為71.0%、65.7%，與HC-Ⅱ相比，兩者的敏感度相近，但前者的特異度較高[12]。而我國目前對于宮頸病變存在過度診治的現象，尤其對CINⅡ的患者；P16對于CIN的診斷有極好的指導作用，可以減少宮頸病變的過度診治。P16陰性的患者術后隨訪超薄細胞檢測（LCT）陰性表達率為84.21%；陽性表達率為15.79%。P16陽性患者進行術后隨訪超薄細胞學檢測，陰性表達率為27.78%，陽性表達率為72.22%。術后隨訪超薄細胞學檢查與P16陽性和陰性表達兩者具有統計學意義 （P<0.05）。可見，P16陽性患者術后病情持續和進展風險更高；P16陰性患者可以采取暫時觀察，以減少不必要的手術創傷。

因此，我們認為在CINⅡ級別病變中，P16陽性與陰性婦女對比，未來進展為更高級別子宮頸癌的風險會明顯增加，因而P16蛋白可以作為有效的指標指導CINⅡ級別病變的臨床治療。從而建議條件允許的情況下，陰道鏡同時行P16檢測，陰性表達患者進行觀察治療，陽性表達患者積極采取錐切治療，采取個體化分流措施以減少生育需求者的創傷。P16染色結果可作為CINⅡ病變轉歸結局的預警指標，可用于CINⅡ患者隨訪的分流管理，優化宮頸癌的篩查流程，對于CINⅡ患者干預或隨訪策略的制定具有指導意義。

4 參考文獻