CD123和CD66c在兒童B-ALL中的表達及其在MRD監測中的應用

鐘嘉穎，吳英英，勞夢曉，張小艷，王春麗，潘建華

（1.廣州醫科大學，廣東 廣州 510182；2.廣州金域醫學檢驗中心臨床血液流式細胞檢測中心，廣東 廣州 510005）

多參數流式細胞術（multiparameter flow cytometry，MFC）是兒童急性B淋巴細胞白血病（B-cell acute lymphoblastic leukemia，B-ALL）免疫分型和微小殘留病（minimal residual disease，MRD）檢測的重要方法。MRD檢測可用于B-ALL患兒的療效判斷和預后評估。MFC是MRD檢測的關鍵，其難點在于對正常B系前體細胞與B-ALL腫瘤細胞進行區分。CD123，即白細胞介素（interleukin，IL）-3受體α鏈，是造血生長因子受體家族成員之一。CD123在急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）干細胞和淋巴細胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）中異常表達[1-3]，但在兒童B-ALL中的表達特點有待進一步確認。CD66c是癌胚抗原（carcino embryonic antigen，CEA）基因家族成員之一，屬非特異性交叉反應性抗原，主要分布于粒細胞、結腸和肺上皮細胞中，在部分成人及早期B-ALL患兒中高表達[4-5]。本研究采用MFC對CD123和CD66c在141例B-ALL患兒中的表達特點進行分析，并探討二者在MRD監測中的應用價值。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2015年6月—2017年6月送檢廣州金域醫學檢驗中心臨床血液流式細胞檢測中心的初診B-ALL患兒標本141例，患兒男80例、女61例，年齡4（1～14）歲，所有病例均經世界衛生組織細胞形態學（morphology）、免疫學（immunology）、細胞遺傳學（cytogenetics）和分子生物學（molecular biology）分型（MICM分型）確診。另選取25例AML患者作為對照組，經治療癥狀完全緩解后采集其骨髓標本，所有標本均含比例不等的正常增生B系前體細胞。

1.2 儀器與試劑

選用FACSCanto Ⅱ流式細胞儀（美國BD公司）。單克隆抗體包括異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）、藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）、多甲藻黃素-葉綠素-蛋白質復合物（peridinin-chlorophyll-protein complex，PerCP） -Cy5.5、PE-Cy7、別藻藍蛋白（allophycocyanin，APC）、APC-H7、V450和V500標記的鼠抗人CD5、CD10、CD20、CD19、CD22、CD123、CD38、CD34、CD33、CD117、CD13、CD7、CD3、IgM、髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、末端脫氧核苷酸轉移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT）、CD45等，均購自美國BD公司。IntraPrep破膜劑購自法國Immunotech公司。溶血素為美國Beckman Coulter公司產品。

1.3 方法

1.3.1 抗體標記及流式細胞術分析 將初診患兒骨髓有核細胞數調至1×105/100 μL，采用多色直接免疫熒光標記法進行染色。每管加入100 μL標本，染色前用10 μL小牛血清常溫封閉10 min，以阻斷Fc受體，加入相應單抗，對細胞表面及胞質內的抗原進行檢測。對照組骨髓淋巴細胞CD123和CD66c檢測方法同初診患兒。使用Diva軟件獲取0.6×105個細胞，并進行分析，細胞表面及胞質內抗原檢測結果以表達＞20%為陽性。

1.3.2 CD123和CD66c在正常B系前體細胞和成熟B淋巴細胞中的表達 采用流式細胞儀檢測對照組經治療癥狀完全緩解后的骨髓標本，以CD45/SSC設門，當CD45弱陽性、懷疑為正常增生B系前體細胞時，選取CD66c/CD123/CD34/CD10/CD19/CD38/CD45抗體組合，進一步分析CD123和CD66c在正常B系前體細胞和成熟B淋巴細胞中的表達情況。

1.3.3 B-ALL患兒治療后MRD檢測 當初診患兒抗原表達不同于對照組（CD123、CD58強表達，CD38、CD45陰性或弱表達，CD13、CD33和CD66c跨系表達）時，選取CD10/CD34/CD19/CD45做進一步MRD抗體組合檢測。B-ALL患兒治療后骨髓標本用Ficoll密度梯度離心法分離單個核細胞，2 000×g離心20 min，吸出白膜層，再用磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）洗滌2遍，調節單個核細胞數至合適的量。每管加入100 μL標本，用10 μL小牛血清常溫封閉10 min后加入相應單抗，對細胞表面抗原進行檢測，每管盡量多地獲取細胞（4×105～10×105個細胞），分析MRD水平，MRD≥0.01%為陽性，MRD＜0.01%為陰性，MRD＞5.00%為復發。

1.4 統計學方法

采用SPSS 16.0軟件進行統計分析。呈正態分布的計量資料以x± s表示，呈非正態分布的計量資料以中位數（M）[四分位數（P25～P75）]表示，組間比較采用單因素方差分析或秩和檢驗，采用Spearman法分析相關性。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CD123和CD66c在正常B系前體細胞和成熟B淋巴細胞中的表達

對照組正常B系前體細胞占有核細胞總數的[7.63（1.76～21.82）]%。根據CD19、CD10、CD34和CD45的表達特點可將正常B系前體細胞分為：（1）CD10熒光強度最強而CD45熒光強度較弱的細胞群，該細胞群CD34陽性，為較早期的B祖細胞（CD19+CD34+）；（2）CD10熒光強度較弱而CD45熒光強度較強的細胞群，該細胞群CD34陰性，為較晚期的B系前體細胞（CD19+CD34-）。CD123在CD19+CD34+和CD19+CD34-上的表達水平分別為[0.46（0.00～2.47）]%和[0.10（0.10～1.07）]%，CD66c的表達水平分別為[0.42（0.00～1.65）]%和[0.21（0.10～1.21）]%。CD123和CD66c在正常B系前體細胞和成熟B淋巴細胞中均不表達。

2.2 CD123和CD66c在兒童B-ALL中的表達

141例B-ALL患兒中分別有6例、123例和12例為早期前體B-ALL（Pro-B-ALL）、普通B-ALL（Common-B-ALL）和前體B-ALL（Pre-B-ALL），其中CD123陽性88例（62.41%），CD66c陽性70例（49.65%），CD123和CD66c均陽性62例（43.97%），CD123或CD66c陽性96例（68.09%）。經Spearman法相關性分析，CD123和CD66c與兒童B-ALL表達呈中度正相關（r=0.641，P＜0.01）。見表1。

2.3 MRD抗體組合檢測

CD123和CD66c在B-ALL腫瘤細胞中的表達不同于正常B淋巴細胞（B系前體細胞和成熟B淋巴細胞），以抗原陽性率≥90%作為治療后MRD監測的指標。141例B-ALL患兒中，CD123或CD66c陽性共96例（68.09%），45例選擇CD123用于監測，52例選擇CD66c用于監測，選擇CD123和CD66c用于監測的病例有35例，選擇CD123或CD66c用于監測的病例有62例，覆蓋率為43.97%。監測指標除CD123和CD66c外，還包括CD38、CD45陰性或弱表達，CD58強表達，CD13、CD33跨系表達。見表2、圖1。

表1 CD123和CD66c在兒童B-ALL中的表達水平

表2 CD123和CD66c在B-ALL患兒MRD監測中的應用[例（%）]

圖1 CD123在B-ALL患兒MRD監測中的應用

3 討論

采用流式細胞術分析兒童B-ALL治療后MRD水平時，受化療或骨髓移植后骨髓增生期的影響，B-ALL患兒的骨髓中會出現造血B系前體細胞數量一過性增加的情況，此階段出現的CD19、CD10雙陽性群體來源于正常造血細胞克隆還是來源于惡性血細胞克隆，需謹慎判斷。目前，形態學方法較難區分正常B系前體細胞與B-ALL腫瘤細胞，且二者的免疫表型也十分相似，故B-ALL的MRD監測主要依賴于正常B系前體細胞免疫表型存在明顯差別的抗原[6-7]。本研究結果顯示，141例B-ALL患兒中CD123表達陽性88例，陽性率為62.41%；CD66c表達陽性70例，陽性率為49.65%。然而，CD123和CD66c在骨髓正常增生B系前體細胞和成熟B淋巴細胞中均不表達。本研究結果和文獻報道結果都顯示骨髓正常增生B系前體細胞和成熟B淋巴細胞均無CD123和CD66c表達[8-10]，提示CD123和CD66c均可作為兒童B-ALL的MRD監測指標。

用于B-ALL MRD監測較好的指標不僅需要在白血病細胞上特異表達，而且還要在化療后殘留腫瘤細胞上穩定表達。本研究MRD監測結果顯示，CD123和CD66c表達均具有良好的穩定性，無衰減或變弱，對CD123和CD66c陽性白血病細胞群的判斷和分析較為容易。經與其他指標（CD58、CD38、CD33和CD13）進行比較發現，CD33和CD13穩定性不夠，復發時部分病例表達減弱或缺失，一些病例的CD58和CD38受熒光強度較正常B系前體細胞分界不明顯的影響，未能較好地對白血病細胞進行辨別。因此，CD123和CD66c是兒童B-ALL MRD監測穩定、特異、敏感的指標。

本研究中141例B-ALL患兒有96例CD123或CD66c陽性（陽性率為68.09%），CD123和CD66c共同用于MRD監測的病例有35例，表明CD123和CD66c常共同表達于B-ALL白血病細胞表面，且經Spearman法相關性分析，CD123和CD66c與兒童B-ALL呈中度正相關（r=0.641，P＜0.01）。因此，CD123和CD66c同時用于兒童B-ALL診斷和MRD監測具有較好的準確性。隨訪期間觀察到2例復發患兒，復發B-ALL腫瘤細胞表面CD123和CD66c表達強度與初診時一致，但由于治療后復發的病例數較少且隨訪時間較短，CD123和CD66c在MRD監測中的穩定性尚需通過增加病例和延長隨訪時間來進行評估。本研究中CD123或CD66c用于MRD監測的病例僅62例（覆蓋率為43.97%），需聯合其他多個篩選指標進行檢測，以提高MRD監測的覆蓋率，同時還可有效減少因化療導致部分患者免疫表型改變而出現的不真實監測結果。