水蛭素對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞增殖的影響及機(jī)制

陶義豐，黃玲莎，劉冬華，勞明，黃浩，黃文成，謝娟

(廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，南寧530021)

鼻咽癌是鼻咽部上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，發(fā)病常較隱匿，臨床確診時(shí)多半患者已為中晚期，放療成為治療鼻咽癌的主要方式[1]。單純放療復(fù)發(fā)率及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率均較高，并且放射常不可避免地?fù)p傷正常組織，導(dǎo)致患者生活質(zhì)量下降；而化療藥物又有不同程度的不良反應(yīng)。因此尋找治療鼻咽癌有效并且毒副反應(yīng)少的藥物是臨床研究熱點(diǎn)之一。活體菲牛蛭是藥用動(dòng)物資源，從歐洲醫(yī)蛭的唾液腺中分離出抗凝物質(zhì)的活性成分并命名為水蛭素[2]。水蛭素具有抗血栓、抗炎、抗氧化、降血脂作用，已廣泛應(yīng)用于心腦血管及血栓性疾病的治療[3，4]。水蛭素還具有抗腫瘤作用，可根據(jù)腫瘤部位及性質(zhì)聯(lián)合或單藥治療血管瘤、肝癌等[5]。2017年6月～2017年12月，本研究探討水蛭素對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞(CNE2)增殖的影響及機(jī)制，以期為進(jìn)一步開發(fā)抗腫瘤中藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2(廣西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心腫瘤實(shí)驗(yàn)室)；天然水蛭素凍干粉(南寧市金海科康生物醫(yī)藥科技有限公司)；RPMI1640(北京賽默飛世爾生化制品有限公司);胎牛血清(上海依科賽生物制品有限公司)；MTT(北京索萊寶科技有限公司)、DMSO(北京索萊寶科技有限公司)、胰酶(北京索萊寶科技有限公司)；Trizol(Invitrogen公司)；RevertAid First Strand cDNA Synthesis(Takara)；SYBR Mix(Takara)；CKX31SF型倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；MK3酶標(biāo)儀(上海熱電儀器有限公司)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)BIO-RAD公司)；微量核酸測(cè)定儀(美國(guó)Thermo公司)。

1.2 CNE2細(xì)胞培養(yǎng)及水蛭素干預(yù) CNE2細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素及100 IU/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用0.25%的胰酶消化傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CNE2細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組與水蛭素組。將細(xì)胞按100 μL/孔接種于96孔板，放入37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。將水蛭素凍干粉加入RPMI1640培養(yǎng)液配置30 ATU/mL母液，采用倍比稀釋法配制相應(yīng)濃度的水蛭素。在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

1.3 CNE2細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率測(cè)算 采用MTT法。對(duì)照組常規(guī)培養(yǎng)，水蛭素組加入不同濃度(2、4、8、16 ATU/mL)的水蛭素，分別于作用24、48、72 h后，每孔加入5 g/L的MTT 20 μL，培養(yǎng)4 h后棄上清液，每孔加入DMSO 150 μL，微量振蕩器搖振蕩10 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定492 nm波長(zhǎng)處的吸光度值(OD)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。抑制率=(1-加藥組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。

1.4 CNE2細(xì)胞內(nèi)Bax、p21 mRNA表達(dá)檢測(cè) 對(duì)照組常規(guī)培養(yǎng)，水蛭素組加入不同濃度(5、8 ATU/mL)的水蛭素進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后取細(xì)胞分別加入胰酶消化，用預(yù)先配備好的培養(yǎng)液中和胰酶，重懸細(xì)胞于15 mL離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加等量培養(yǎng)液打散，轉(zhuǎn)至EP管，以同樣的條件再次離心后，每EP管分別加入的TRIzol 1 mL，室溫下靜放10 min；每管加入氯仿0.2 mL振蕩60 s，冰上靜置10 min；按照說明書要求，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，EP管內(nèi)分三層，收集上層溶液，即目標(biāo)RNA。加入異丙醇0.2 mL，混勻，冰上置10 min；離心，棄上清液，獲得實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)產(chǎn)物RNA；用75%乙醇洗滌管內(nèi)白色沉淀，離心去上清液純化目標(biāo)；加入無酶去離子水20 μL保存。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR擴(kuò)增體系：premix ex taqTM 12.5 μL，β-actin上游引物0.75 μL，β-actin下游引物0.75 μL，RNase-free Water 10 μL，cDNA模板1 μL；premix ex taqTM 12.5 μL，p21上游引物0.75 μL，p21下游引物0.75 μL，RNase-free Water 10 μL，cDNA模板1 μL；premix ex taqTM 12.5 μL，Bax上游引物0.75 μL，Bax下游引物0.75 μL，RNase-free Water 10 μL，cDNA模板1 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 2 min，94 ℃ 20 s，60 ℃ 35s，共40個(gè)循環(huán)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司提供，擴(kuò)增產(chǎn)物289 bp。采用β-actin作為內(nèi)參，β-actin的拷貝數(shù)作為校正基數(shù)，實(shí)驗(yàn)獲得各樣本的Ct值與同樣本中的內(nèi)參Ct值相減即獲得目的基因相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 CNE2細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 對(duì)照組細(xì)胞貼壁良好，細(xì)胞形態(tài)大小基本一致，大多為多邊形似鋪路石狀，輪廓清晰，連接緊密；折光性強(qiáng)，胞膜完整，胞質(zhì)均勻、透明，胞質(zhì)內(nèi)顆粒較少。水蛭素組經(jīng)5 ATU/mL水蛭素作用24 h后，細(xì)胞貼壁一般，可見細(xì)胞縮小，折光性弱，些許細(xì)胞漂浮；作用48 h后，細(xì)胞形態(tài)改變更加明顯，折光性明顯減弱，小片細(xì)胞皺縮變小，抱團(tuán)漂浮。8 ATU/mL水蛭素作用24 h后，貼壁細(xì)胞減少，細(xì)胞皺縮變圓，折光性減弱，片狀漂浮成團(tuán)；作用48 h后貼壁細(xì)胞明顯減少，偽足斷裂，折光性減弱，大量細(xì)胞皺縮變圓，成片細(xì)胞漂浮結(jié)團(tuán)，細(xì)胞碎片增多，細(xì)胞凋亡明顯，并釋放出大量代謝顆粒。

2.2 水蛭素對(duì)CNE2細(xì)胞增殖的影響 不同濃度不同時(shí)間點(diǎn)水蛭素組生長(zhǎng)抑制率均高于對(duì)照組，水蛭素組各濃度各時(shí)間點(diǎn)生長(zhǎng)抑制率比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，有濃度、時(shí)間依賴性。見表1。根據(jù)水蛭素作用CNE2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率，計(jì)算藥物作用24、48、72 h水蛭素組的IC50分別為(8.28±2.1)、(5.11±0.7)、(4.83±0.5)ATU/mL，48、72 h時(shí)間點(diǎn)IC50比24 h高(P均<0.05)，72 h與48 h比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 水蛭素對(duì)CNE2細(xì)胞增殖的影響(%，±s)

2.3 水蛭素對(duì)CNE2細(xì)胞內(nèi)Bax、p21 mRNA表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，5、8 ATU/mL水蛭素組Bax、p21 mRNA相對(duì)表達(dá)量高(P均<0.05)，8 ATU/mL水蛭素組最高(P均<0.05)。見表2。

表2 各組Bax、p21 mRNA表達(dá)比較±s)

3 討論

鼻咽癌是好發(fā)于頭頸部的惡性腫瘤，易發(fā)生轉(zhuǎn)移。盡管放化療技術(shù)不斷改進(jìn)，但是鼻咽癌發(fā)生位置隱匿，易局部轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及耐藥性高導(dǎo)致患者5年生存率低。因此，開發(fā)新型可靠、有效的藥物刻不容緩。目前天然抗腫瘤藥物的研究已受到越來越多的關(guān)注，臨床一線抗腫瘤藥如紫杉醇、長(zhǎng)春堿等得到廣泛應(yīng)用。近年來，水蛭素治療惡性腫瘤的效果也引起廣泛關(guān)注。

活體菲牛蛭是具有廣西特色的藥用動(dòng)物資源。《神農(nóng)本草經(jīng)》認(rèn)為水蛭有破血通經(jīng)，逐瘀消瘕之效[6]。17世紀(jì)就已經(jīng)在水蛭中提取了抗凝物質(zhì)[7]。直到1957年，Markwardt[2]才從歐洲醫(yī)蛭的唾液腺中分離出這種抗凝物質(zhì)的活性成分，并命名為水蛭素。水蛭素具有多種生物活性的天然產(chǎn)物[8]，富含錳、鎂、鋅等元素。藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)認(rèn)為水蛭素抗癌機(jī)制可能源于其高抗凝作用，可促進(jìn)藥理活性物質(zhì)及免疫活性細(xì)胞侵入腫瘤，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[9，10]。水蛭素作用于體外培養(yǎng)的人舌鱗癌TCA8113細(xì)胞呈現(xiàn)出劑量依賴性的抑制效應(yīng)，且聯(lián)合阿霉素后有較好的增效減毒作用[11]。水蛭素通過下調(diào)B淋巴細(xì)胞瘤-2基因及上調(diào)促凋亡蛋白的表達(dá)誘導(dǎo)喉癌Hep-2細(xì)胞凋亡，且可明顯降低血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2和局部黏著斑激酶的表達(dá)，從而抑制Hep-2細(xì)胞遷移、黏附和入侵[12]。眾多對(duì)水蛭素抗癌抑瘤功效的研究表明,水蛭素通過抑制纖維蛋白形成，切斷腫瘤細(xì)胞的纖維蛋白形成或血小板聚集這一過程，最終達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的功效[13]。重組水蛭素可以抑制小鼠腫瘤的生長(zhǎng)，并能夠進(jìn)一步促進(jìn)長(zhǎng)春新堿抑制黑色素瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[14]，表明水蛭素具有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移甚至誘導(dǎo)凋亡的功能[15,16]。但是，水蛭素對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞的影響尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。

本文選取人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2為靶細(xì)胞進(jìn)行水蛭素抗腫瘤效應(yīng)的研究，觀察不同濃度、不同時(shí)間點(diǎn)的水蛭素對(duì)CNE2細(xì)胞增殖抑制的影響。結(jié)果表明，水蛭素在2～16 ATU/mL濃度范圍內(nèi)對(duì)人鼻咽癌CNE2細(xì)胞增殖均有抑制作用，且水蛭素作用于CNE2細(xì)胞24、48、72 h的IC50值逐漸降低。可見水蛭素對(duì)CNE2細(xì)胞的抑制作用具有時(shí)間、劑量依賴性。

p21是一種廣譜細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子，可競(jìng)爭(zhēng)性地與細(xì)胞周期蛋白結(jié)合，從而抑制該酶活性，減少靶蛋白磷酸化。王文蘭等[17]認(rèn)為冬凌草甲素通過使p21mRNA表達(dá)增加來誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生G2期阻滯，黃連堿對(duì)人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞周期阻滯于G2期時(shí)檢測(cè)到p21表達(dá)增加[18]。同時(shí)還有研究者發(fā)現(xiàn)p21這個(gè)抑癌基因在鼻咽癌發(fā)病過程中起著重要作用，p21基因3’UTR多態(tài)性與鼻咽癌發(fā)病的啟動(dòng)密切相關(guān)[19]，nt590 p21基因多態(tài)性也與鼻咽癌易感性有著密切聯(lián)系。本研究通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)水蛭素作用于人鼻咽癌CNE2細(xì)胞24 h后， 5 ATU/mL組和8 ATU/mL組的p21 mRNA表達(dá)升高。顯示水蛭素可能通過增加p21的表達(dá)而導(dǎo)致人鼻咽癌CNE2細(xì)胞周期阻滯，增殖抑制，但具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究證實(shí)。

Bax作為Bcl-2家族成員之一，是家族所有促凋亡基因中最具有代表性的。在細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，Bax在凋亡因子刺激下通過寡聚化在線粒體外膜上形成微孔通道，使細(xì)胞色素C及凋亡誘導(dǎo)因子從線粒體內(nèi)輕易進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì)，導(dǎo)致胞質(zhì)中的離子中和了線粒體內(nèi)外膜間隙中的離子，使線粒體跨膜電位喪失，外膜腫脹釋放出凋亡相關(guān)的蛋白，可進(jìn)一步誘導(dǎo)凋亡[20～23]。本研究分別經(jīng)5、8 ATU/mL水蛭素作用24 h后，CNE2細(xì)胞內(nèi)Bax基因表達(dá)較對(duì)照組高。顯示水蛭素可能通過升高Bax的表達(dá)改變CNE2細(xì)胞線粒體膜的通透性，進(jìn)而對(duì)細(xì)胞增殖抑制產(chǎn)生影響。

本研究以天然水蛭素對(duì)人鼻咽癌CNE2細(xì)胞的作用為切入點(diǎn)，在CNE-2細(xì)胞模型中采用MTT法測(cè)定其對(duì)CNE-2細(xì)胞有生長(zhǎng)抑制作用，利用RT-PCR觀察水蛭素可使CNE2細(xì)胞Bax和p21mRNA表達(dá)均增高，此結(jié)果可為水蛭素類抗腫瘤藥物的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。