急性ST段抬高型心肌梗死患者血漿miR-1、miR-146b的表達及臨床意義

陳其敬，羅江賓，張云波，陳林

(三亞市人民醫院，海南三亞 572000)

急性ST段抬高型心肌梗死(STEMI)是臨床常見的心肌梗死類型[1，2]，心電圖和心肌標志物如心肌肌鈣蛋白I(cTn I)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)[3]對其診斷具有重要意義。cTnI在胸痛發作4～12 h即可檢測到，但對STEMI早期診斷的敏感度不足；同時cTnI在其他心肌損傷疾病中亦有升高，其診斷STEMI的特異性也較差[4,5]。CK-MB主要存在于心肌中，STEMI發病24 h才能達到高峰，也不能滿足STEMI早期診斷的需求[3]。近年來，微小核糖核酸(miRNAs)參與心肌損傷、心肌肥厚、心律失常等心血管疾病發展過程的報道逐漸增多[6,7]。本文就STEMI患者血漿miR-1、miR-146b的表達及臨床意義探討如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2016年3月～2017年2月本院收治的STEMI患者79例(觀察組)，其診斷均符合2012年全球統一心肌梗死的定義[8]。納入標準：①年齡超過18歲；②臨床資料完整，且臨床依從性高；③患者及其家屬同意本研究，并簽署知情同意書。排除標準：①合并先天性心臟病、心房纖顫、外周血管疾?。虎诤粑δ芩ソ摺⒙宰枞苑渭膊?；③入組前1個月內進行腎臟替代治療。另外選擇同期在本院進行治療的非STEMI胸痛患者59例(對照組)，兩組性別、年齡、高血壓史、糖尿病史、吸煙史構成及BMI、收縮壓、舒張壓、TC水平比較差異無統計學意義(P均>0.05)。本研究所有過程均符合醫院醫學倫理委員會的相關規定，并獲醫學倫理委員會批準實施。

1.2 血漿樣本采集 患者發病后不同時間點：入院時(T0)以及入院12 h(T1)、24 h(T2)、48 h(T3)、7 d(T4)采集全血樣本5 mL，置于涂有肝素鈉的采血管中，以3 000 r/min離心10 min，分離上清液獲得血漿，置于-80 ℃冰箱中備用待測。

1.3 血漿CK-MB和cTnI水平檢測 采用酶聯免疫吸附測定法檢測血漿CK-MB和cTnI水平，試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.4 血漿miR-1、miR-146b檢測 采用實時定量PCR 法。使用Trizol試劑(美國Invitrogen公司)提取全血總RNA，具體操作按照說明書進行。應用M-MLV逆轉錄酶將2 μg總RNA轉錄合成為cDNA，內參設置為U6。逆轉錄印務序列如下：miR-1：5′-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTG

CACTGGATACGACTACATAC-3′；miR-146b：5′-GGGGTGAGAACTGAATTCCAGTGCGTGTCGTGGAG

TCG3′；U6：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。采用SYBR Green PCR Master Mix(美國ABI公司)試劑盒，反應體系變性95 ℃、15 s，退火60 ℃、20 s，延伸70 ℃、10 s，一共進行40個循環。Ct值為樣本表達標準量，血漿miR-1、miR-146b相對表達水平以2-ΔΔCt計算。

1.5 冠脈造影評分 采用美國心臟病學會/美國心臟學會評分法評估冠狀動脈病變的嚴重程度[9]。常規經橈動脈途徑或股動脈入路對7個體位進行造影，選擇8支主要血管進行評分。狹窄程度<10%為0分；10%≤狹窄程度<49%為1分；50%≤狹窄程度<74%為2分；75%≤狹窄程度<89%為3分；90%≤狹窄程度<100%為4分。權重系數均為1，每支血管評分=每支血管的權重系數×狹窄程度權重系數，總分為8支血管評分總和。

2 結果

2.1 兩組血漿CK-MB及cTnI水平比較 觀察組血漿CK-MB、cTnI表達水平高于對照組，差異有統計學意義(P均<0.05)。見表1。

表1 兩組血漿CK-MB、cTnI水平比較±s)

注：與對照組比較，*P<0.05。

2.2 觀察組不同發病時刻血漿miR-1、miR-146b水平變化 與對照組相比，觀察組T0、T1、T2及T3時血漿miR-1、miR-146b表達水平均升高(P均<0.05)。觀察組血漿miR-1、miR-146b表達水平不同發病時刻先升高后降低，在T1時血漿miR-1、miR-146b表達水平最高，與其他時間點比較差異有統計學意義(P均<0.05)；觀察組T4時血漿miR-1、miR-146b表達水平與對照組之間的差異無統計學意義(P均>0.05)。見表2。

表2 觀察組不同發病時刻血漿miR-1、miR-146b水平變化±s)

注：與對照組比較，*P<0.05;與觀察組T0、T2、T3、T4比較，△P<0.05。

2.3 STEMI患者血漿miR-1、miR-146b表達與CK-MB、cTnI水平及冠脈造影評分的關系 STEMI患者血漿miR-1表達水平與CK-MB、cTnI水平及冠脈造影評分呈正相關(r分別為0.738、0.729、0.693，P均<0.05)，血漿miR-146b表達水平與CK-MB、cTnI水平及冠脈造影評分亦呈正相關(r分別為0.715、0.706、0.732，P均<0.05)。

3 討論

miRNAs由19～25個核苷酸組成，為一段發卡環結構的單鏈RNA前體剪切后生成，廣泛存在于真核細胞中，獨立于其他基因，不能翻譯成蛋白質，可與目的信使RNA的3′非翻譯區特異性結合，通過切割和降解信使RNA從而抑制目的蛋白的表達[10,11]。已經發現超過1 000種人類miRNAs與相應蛋白質結合后形成穩定的復合體，抑制RNA酶的降解，從而在內環境中穩定存在成為臨床檢測指標[12]。目前對于miRNAs的應用主要集中兩方面：一方面基于miRNAs特性尋求個性化治療途徑，另一方面篩選特異性生物標志物為臨床治療提供靶點。臨床多采用實時定量PCR技術定量分析血漿miRNAs表達水平[13]。

miR-1基因定位于人類20號染色體，在肌肉及心肌組織中高度表達[14]，miR-1參與心肌細胞的分化、凋亡及心臟發育過程，并且影響冠狀動脈疾病、心力衰竭等心血管疾病的發生及發展。miR-1是心肌細胞中表達水平最高的miRNAs，參與心肌前體細胞分化、心肌肥厚及心肌梗死的發生過程，檢測外周血miR-1水平對于急性心肌梗死的診斷及其他相關性心血管疾病的防治具有重要意義。健康機體血漿中miR-1的含量極低。急性心肌梗死患者的心肌細胞破裂，使得miR-1進入血液循環，血漿中miR-1的表達水平升高，在一定程度上可以反映心肌損傷程度，并且可為預后評估提供證據[15]。miR-146家族成員包括miR-146a和miR-146b。miR-146b位于人體第10號染色體，在多種細菌成分刺激人類單核細胞的抗菌譜研究中均可發現[16]。國內對于miR-146b研究多集中于腫瘤及炎癥方面，對于急性心肌梗死的研究鮮有報道。動物實驗結果表明，miR-146b在心肌缺血、再灌注損傷及病毒性心肌炎中表達水平升高[17]。本研究STEMI患者血漿miR-1、miR-146b、CK-MB及cTnI表達水平均高于對照組，同時與對照組相比，STEMI患者T0、T1、T2及T3時血漿miR-1、miR-146b表達水平均明顯升高；STEMI患者血漿miR-1、miR-146b表達水平先升高后降低，在T1時表達水平最高，具有時間依賴性。相關性分析結果發現，STEMI患者血漿miR-1和miR-146b表達水平與CK-MB、cTnI水平及冠脈造影評分呈正相關，說明血漿miR-1和miR-146b升高可提示STEMI的發生。有研究顯示，冠狀動脈閉塞致使心肌缺血而發生心肌梗死，miR-1通過抑制B細胞淋巴瘤/白血病2抗凋亡因子和胰島素樣生長因子1的表達加速心肌細胞凋亡，增加梗死面積[14]。動物實驗結果發現，miRNA釋放到體循環的過程具有相對選擇性。其中miR-1具有心肌特異性，心肌梗死時間長短對于miR-1釋放進體內的過程有重要影響[18]。miR-1加速心臟祖細胞分化為心肌細胞，同時將成纖維細胞編程為心肌細胞樣細胞，通過促進心肌細胞增生從而治療急性心肌梗死[19]。急性心肌梗死的病理基礎為冠狀動脈粥樣硬化、細胞內皮損傷及炎癥反應。miR-146b是炎癥反應調節因子，通過介導炎癥反應損傷內皮組織，進而參與心血管疾病的發生及發展。

綜上所述，血漿miR-1和miR-146b水平變化與STEMI患者血漿標志物CK-MB、cTnI水平關系密切，是診斷STEMI的潛在生物標志物，可能為臨床STEMI治療提供新的靶點。