黃連素對(duì)人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞鈣化的作用及其機(jī)制

張?chǎng)矽i，曾存良，孫曉磊，何虎強(qiáng)，胥雄飛，曾宏，施森，劉勇

(1成都市第三人民醫(yī)院，成都610031；2 達(dá)州市中心醫(yī)院；3西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院)

血管鈣化是糖尿病、慢性腎病、高血壓患者常見(jiàn)病理表現(xiàn)，以動(dòng)脈內(nèi)膜鈣化及動(dòng)脈中膜鈣化為主[1]。近年研究表明，動(dòng)脈中膜鈣化是多種因素及信號(hào)通路參與調(diào)控人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞(HASMCs)成骨分化的過(guò)程，與糖尿病心血管并發(fā)癥及病死率升高密切相關(guān)[2]。本課題前期研究顯示，糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)可誘導(dǎo)HASMCs向成骨細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，與誘發(fā)炎癥、氧化應(yīng)激、凋亡因子生成以及激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路相關(guān)[3]。黃連素是一種具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗腫瘤等多種功效的植物生物堿，可通過(guò)下調(diào)ERK/p38 MAPK抑制HASMCs增殖[4]，減緩成軟骨分化過(guò)程，縮小動(dòng)脈粥樣硬化斑塊[5]。但是，其是否能夠抑制AGEs誘導(dǎo)HASMCs鈣化鮮有報(bào)道。2015年11月～2017年3月我們?cè)贏GEs誘導(dǎo)體外HASMCs鈣化模型基礎(chǔ)上，探究黃連素通過(guò)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)/p38 MAPK通路防止血管鈣化的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 原代HASMCs及培養(yǎng)基(美國(guó)Sciencell公司)，黃連素(美國(guó)Sigma公司)，細(xì)胞內(nèi)鈣含量試劑盒、細(xì)胞馮庫(kù)薩和茜素紅染色試劑盒(上海杰美基因公司)，骨保護(hù)素(OPG)、骨橋蛋白(OPN)及骨形成蛋白-2(BMP-2)(英國(guó)Abcam公司)，ERK、p38 MAPK蛋白(美國(guó)CST公司)。

1.2 HASMCs培養(yǎng)、分組及處理 復(fù)蘇HASMCs，用HASMCs培養(yǎng)基在37 ℃、5%CO2濕熱培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用0.125%胰蛋白酶消化傳代，傳代后取4～10代培養(yǎng)細(xì)胞作為研究對(duì)象。 取上述平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)至融合狀態(tài)后，置于6孔板中進(jìn)行如下分組及處理。①對(duì)照組：加入生理鹽水；②DMSO組：加入0.1% DMSO；③AGEs組：加入100 mg/L AGEs[6]；④AGEs+黃連素組：加入100 mg/L AGEs及不同濃度黃連素(10、25、50 μmol/L)。每組設(shè)3個(gè)副孔，細(xì)胞每隔3 d換液1次，連續(xù)培養(yǎng)7 d。

1.3 HASMCs鈣化染色鑒定 ①馮庫(kù)薩染色：細(xì)胞種于12孔板予以不同刺激14 d后，加入500 μL馮庫(kù)薩固著液，浸潤(rùn)細(xì)胞爬片，室溫孵育10 min，小心移除固著液，PBS清洗3次，加入500 μL馮庫(kù)薩染色液，室溫至于太陽(yáng)光直射下60 min，移去染色液，PBS清洗3次，取出爬片，空氣中晾干，顯微鏡下鈣鹽沉積處為黑色。②茜素紅染色：細(xì)胞種于12孔板予以不同刺激14 d后，加入500 μL茜素紅固著液，浸潤(rùn)細(xì)胞爬片，室溫孵育10 min，小心移除固著液，PBS清洗3次，加入500 μL茜素紅染色液30 min，移去染色液，PBS清洗3次，取出爬片，空氣中晾干，顯微鏡下橘紅色為鈣化結(jié)節(jié)。

1.4 HASMCs鈣含量測(cè)定 細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫6孔板細(xì)胞，加入3 mL PBS 混勻細(xì)胞，移入15 mL預(yù)冷錐形離心管，放入4 ℃離心機(jī)1 000 r/min離心5 min；小心移去上清液，加入200 μL裂解液，轉(zhuǎn)入1.5 mL預(yù)冷離心管，渦旋震蕩15 s，靜置冰槽30 min，4 ℃ 12 500 r/min 離心10 min，小心移去上清液至新預(yù)冷1.5 mL離心管，移取10 μL用細(xì)胞鈣離子定量試劑盒測(cè)定，酶標(biāo)儀波長(zhǎng)設(shè)置為570 nm。

1.5 HASMCs內(nèi)各類蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。提取6孔板內(nèi)貼壁細(xì)胞總蛋白，取各組樣本蛋白20 μg行SDS-PAGE 電泳分離蛋白。用400 mA 1 h 電轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用5% 脫脂奶粉封閉1 h后，分別加入一抗孵過(guò)夜，洗膜后加入HRP標(biāo)記的二抗孵育1 h，充分洗滌后加入增強(qiáng)發(fā)光液，即刻與底片曝光，并用Quantity One軟件系統(tǒng)進(jìn)行光密度分析。選擇AGEs作用15 min作為MAPK信號(hào)通路各蛋白表達(dá)的最適測(cè)量時(shí)間[7]。

2 結(jié)果

2．1 各組HASMCs染色變化 ①馮庫(kù)薩染色顯示：與對(duì)照組相比，AGEs組HASMCs透明度降低，呈多層疊加生長(zhǎng)，部分細(xì)胞破碎，且黑色沉淀區(qū)域面積明顯增多；相比于AGEs組，AGEs+黃連素組，黑色沉淀區(qū)域面積明顯減少，且隨黃連素濃度增加而減少。②茜素紅染色顯示：與對(duì)照組相比，AGEs組橘紅色鈣化結(jié)節(jié)明顯增加；與AGEs組相比，AGEs+黃連素組橘紅色鈣化結(jié)節(jié)明顯減少。

2.2 各組HASMCs內(nèi)鈣含量 對(duì)照組、 DMSO組、 AGEs組、 AGEs+10 μmol/L黃連素組、AGEs+25 μmol/L黃連素組、AGEs+50 μmol/L黃連素組鈣含量分別為(0.646±0.199)、(0.805±0.151)、(4.203±0.234)、(3.394±0.229)、(2.895±0.392)、(2.135±0.399)mmol/g。與對(duì)照組相比，AGEs組胞內(nèi)鈣含量增加(P<0.05)，說(shuō)明AGEs可以誘導(dǎo)HASMCs鈣化。與AGEs組相比，AGEs+不同濃度黃連素組胞內(nèi)鈣含量降低(P均<0.05)，且AGEs+不同濃度黃連素組之間胞內(nèi)鈣含量隨濃度增加而下降(P均<0.05)。

2.3 各組HASMCs內(nèi)OPG、BMP2、OPN蛋白表達(dá) 與對(duì)照組相比，AGEs組OPG、BMP2、OPN表達(dá)量增高(P均<0.05)；與AGEs組相比，AGEs+黃連素處理組OPG、BMP2、OPN表達(dá)量降低(P均<0.05)，且AGEs+不同濃度黃連素組HASMCs內(nèi)OPG、BMP2、OPN蛋白表達(dá)隨濃度增加而下降(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組HASMCs內(nèi)OPG、BMP2、OPN蛋白表達(dá)(n=3,±s)

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05；與AGEs組相比，**P<0.05。

2.3 各組HASMCs內(nèi)ERK、p38 蛋白表達(dá) 與對(duì)照組相比，AGEs組HASMCs內(nèi)ERK、p38 蛋白表達(dá)增高(P均<0.05)；與AGEs組相比，加入不同濃度黃連素組ERK、p38蛋白表達(dá)量減少(P均<0.05)，且AGEs+不同濃度黃連素組HASMCs內(nèi)ERK、p38 蛋白表達(dá)隨濃度增加而下降(P均<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組HASMCs內(nèi)ERK、p38 蛋白表達(dá)(n=3,±s)

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05；與AGEs組相比，**P<0.05。

3 討論

近年研究表明，血管鈣化與糖尿病腎病、心肌梗死、腦卒中等多種疾病密切相關(guān)，細(xì)胞外基質(zhì)理化性質(zhì)改變及血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化對(duì)血管鈣化至關(guān)重要[8]，其中血管平滑肌細(xì)胞表型改變、胞內(nèi)鈣含量增加與磷酸酶活性增強(qiáng)等在血管鈣化中起重要作用[9]。血管平滑肌細(xì)胞是參與血管鈣化調(diào)控主要因子之一，在糖尿病患者體內(nèi)過(guò)高的血糖濃度及胰島素抵抗增強(qiáng)將促進(jìn)AGEs大量生成，AGEs刺激細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成改變，激發(fā)AGEs-RAGE信號(hào)軸，進(jìn)而激活一系列信號(hào)通路，誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞成骨分化，促進(jìn)糖尿病血管鈣化[10]。

血管鈣化是與骨發(fā)育相似的主動(dòng)、高度可調(diào)控的復(fù)雜病理生理過(guò)程，且在上述各種因素刺激下血管中膜HASMCs表型由收縮型轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣煞置谛?，并最終發(fā)展為成骨樣細(xì)胞表型[11]，而表型轉(zhuǎn)化后的平滑肌細(xì)胞具有成骨樣細(xì)胞特點(diǎn)：即質(zhì)膜上都表達(dá)堿性磷酸酶，分泌Ⅰ型膠原、OPN、骨鈣蛋白和骨連蛋白，而這些蛋白均受MAPK信號(hào)的調(diào)控[12]。研究發(fā)現(xiàn)，AGEs/RAGE軸活化多種細(xì)胞因子使MAPK激活，致MAPK下游因子入核進(jìn)一步調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、氧化應(yīng)激、脂質(zhì)代謝、鈣磷代謝等生理過(guò)程，誘導(dǎo)組織分化及凋亡[13]。MAPK是多種胞外刺激的關(guān)鍵因素，在調(diào)節(jié)細(xì)胞多種生理過(guò)程起重要作用。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，ERK、p38 MAPK途徑通過(guò)調(diào)節(jié)增殖、分化功能，實(shí)現(xiàn)參與胚胎期的骨生長(zhǎng)發(fā)育、出生后的骨量平衡、骨折愈合等眾多骨生長(zhǎng)改建過(guò)程。大量研究表明，MAPK信號(hào)通路是骨形成過(guò)程中最關(guān)鍵的信號(hào)通路。Chen等[14]發(fā)現(xiàn)敲除ERK1/2、p38 MAPK的小鼠骨形成和骨再吸收明顯受到抑制，并且阻止骨髓間充質(zhì)祖細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。Chen等[15]發(fā)現(xiàn)MAPK信號(hào)的激活促進(jìn)與骨形成有關(guān)的蛋白表達(dá)。

已經(jīng)證實(shí)，黃連素在糖尿病患者降血糖方面以及抗炎、抗病毒、降脂等方面具有重要作用。近期研究表明，低濃度黃連素抑制p38/JNK MAPK磷酸化，緩解小鼠左心室重構(gòu)并減少心肌梗死病死率。Cui等[16]研究發(fā)現(xiàn)黃連素通過(guò)抑制ERK/p38/JNK MAPK抑制胰腺炎癥因子Th17及Th1分泌，實(shí)現(xiàn)小鼠I型糖尿病治療。在糖尿病慢性腎臟疾病腎組織炎癥信號(hào)通路中，黃連素可抑制p38 MAPK干預(yù)炎癥反應(yīng)；抑制高糖誘導(dǎo)的腎系膜細(xì)胞增殖及細(xì)胞外基質(zhì)沉積，進(jìn)而防止腎血管纖維化[17]，此外，黃連素可通過(guò)下調(diào)ERK/p38/JNK MAPK信號(hào)通路，抑制肺癌、肝癌等腫瘤細(xì)胞增殖。本研究證實(shí)黃連素可以抑制AGEs誘導(dǎo)的HASMCs鈣化，并且通過(guò)部分抑制AGEs對(duì)ERK/p38 MAPK磷酸化的激活作用，進(jìn)而減少HASMCs成骨分化表型OPG、BMP2、OPN表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)抑制其鈣化作用。

本研究同時(shí)從馮庫(kù)薩及茜素紅兩種染色法證實(shí)AGEs促HASMCs鈣化灶形成，黃連素可以抑制AGEs誘導(dǎo)HASMCs鈣化作用。而大量研究表明HASMCs鈣化與HASMCs增殖、遷移、凋亡呈正相關(guān)[18]，間接印證黃連素具有抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖遷移能力。同時(shí)本研究證實(shí)AGEs上調(diào)ERK/p38 MAPK磷酸化表達(dá)量，這與近年研究ERK/p38 MAPK磷酸化表達(dá)量同HASMCs鈣化呈正相關(guān)相符合[19]；而黃連素可下調(diào)AGEs這一作用，其抑制AGEs誘導(dǎo)HASMCs鈣化與ERK/p38 MAPK密切相關(guān)。

綜上所述，黃連素可通過(guò)調(diào)控AGEs-ERK/p38 MAPK軸，抑制ERK/p38 MAPK通路表達(dá)激活，實(shí)現(xiàn)對(duì)AGEs誘導(dǎo)HASMCs向成骨細(xì)胞分化作用削減，進(jìn)而緩解糖尿病患者動(dòng)脈中膜鈣化。其機(jī)制可能與減少相關(guān)因子胞質(zhì)/胞核轉(zhuǎn)位，使OPG、BMP2、OPN等成骨分化因子表達(dá)量減少密切相關(guān)。黃連素調(diào)控MAPK通路在抑制糖尿病血管鈣化過(guò)程中的分子機(jī)制可為尋找臨床藥物治療新靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。