急性呼吸道感染患兒中檢出B1基因亞型人偏肺病毒

范國權 劉曉莉 蔚京京

急性呼吸道感染(acute respiratory infection,ARI)是兒科門診和住院的常見病,病毒是兒童ARI的主要病原。多數兒童ARI由呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)、流感病毒(influenza virus)、副流感病毒(parainfluenza paramyxovirus)、冠狀病毒(coronavirus,CoV)、腸道病毒(enterovirus,EV)、腺病毒(adenovirus,ADV)、鼻病毒(rhinovirus)引起,除此以外尚有一部分兒童ARI的病原學原因不明確［1-2］。近年來報道人類細小病毒(human parvovirus)［3］、人偏肺病毒(human metapneumovirus,HMPV)［4］也是引起兒童ARI的重要病原,可以解釋部分不明原因兒童ARI的病因。

近年來,我國部分地區在兒童ARI患者中相繼檢出HMPV和人細小病毒［5-6］,證實這2種病毒也是引起國內兒童ARI的病原。目前的資料顯示國內較多地區在兒童ARI患者中檢出HMPV,顯示HMPV可能是我國兒童ARI的常見病原［7-9］。山西省尚未開展HMPV病原學、流行病學等方面的研究。本研究在山西省太原市 ARI患者中檢測到HMPV并對其進行分型研究。

1 材料與方法

1.1 標本來源 2007年1月1日至12月31日到山西省兒童醫院呼吸科治療的兒童ARI患者,選擇年齡1～5歲并且在太原市居住的患兒采集鼻咽洗液,每個季度各采集25份標本。標本采集后暫時在-20℃冰箱凍存,1周內送山西醫科大學微生物和免疫教研室檢測。本研究獲得山西醫科大學倫理委員會批準,標本采集經患兒家屬知情同意。

1.2 核酸提取和病毒基因擴增 采用Qiagen公司的QIAamp Viral Minikit試劑盒從鼻咽洗液中提取RNA。隨機六聚體引物pd(N)6購自TaKaRa公司,稀釋至20 pmol/μl備用。逆轉錄試劑采用美國Amersham Biosciences公司的Ready-To-Go You-Prime First-Strand Beads試劑盒。核酸提取和逆轉錄依據試劑盒操作說明進行。

取RNA樣品 30 μl加入無 RNA酶離心管,65℃ 10 min,冰浴2 min,短暫離心；吸出25 μl RNA樣品轉移至cDNA合成反應管內,避免混懸；加入1 μl稀釋好的隨機六聚體引物pd(N)6和7 μl DEPC處理的水,使最終容量達到33 μl,室溫靜置約1 min；輕輕混懸或反復吹打,混勻管內成分,短暫離心；37℃水浴60 min,合成的cDNA直接進行聚合酶鏈式擴增(polymerase chain reaction,PCR)。

HMPV核蛋白(nucleoprotein,N)基因擴增引物為 Nup/Ndown［10］,其中上游引物 Nup 序列為 5′-ATGGGACAAGTGAAAATGTC-3′,下游引物 Ndown序列為 5′-GCATTT(G)CCGAGAACAACAAC-3′,預期擴增產物長度982 bp。由上海生工生物技術有限公司合成,稀釋至20 pmol/μl備用。PCR反應條件為95 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s、55 ℃ 1 min、72 ℃ 45 s,共35個循環；72℃ 5 min。擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3 病毒基因序列測定與系統進化分析 PCR產物核酸序列測定由北京華大基因有限公司完成。核酸序列拼接采用ATGC和DNAStar中的Seqman軟件,核酸序列推導氨基酸序列采用DNAStar中的EditSequence軟件,核酸和氨基酸序列在NCBI網站進行BLAST比對,采用ClustalW1.83進行序列比對,采用 MEG3.1軟件以鄰接法(Neibour-joining Method)對N基因序列進行系統進化分析,Bootstrap值設定為1 000。

2 結果

2.1 N基因擴增 100份標本全部提取RNA,以隨機引物逆轉錄制備cDNA,以引物Nup/Ndown進行PCR擴增,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示從2月份采集的1份標本和11月份采集的2份標本中擴增到大小約1 000 bp的條帶,其余標本未擴增到大小符合預期的PCR產物。2月份的1份標本來自1名3歲男童(標本編號SY0702M13),11月份的2份標本中1份來自1名1歲6月齡男童(標本編號SY07 11M06),另1份來自1名2歲女童(標本編號SY07 11F09),3名兒童均以 ARI就診治療。上述RTPCR結果提示這3份標本可能為HPMV陽性標本。2.2 核酸序列測定與比對 序列測定結果顯示PCR擴增產物全長982 bp,符合Nup/Ndown引物預期擴增產物大小。以標本編號代表所測定核酸序列,將獲得的核酸序列在NCBI網站進行BLASTn比對,結果顯示與HMPV同源性＞83%；其推導氨基酸序列進行BLASTx比對,結果顯示與HMPV同源性＞90%；所測定核酸序列相互間同源性＞98%。上述結果高度提示這3份標本中的HMPV為同一基因型HMPV。

2.3 N基因系統進化分析 收集GenBank中代表性HMPV N基因核酸序列,與SY0702M13、SY0711M06、SY0711F09標本N基因核酸序列共同進行系統進化分析,結果顯示所有的HMPV分為A、B兩個基因型,A基因型內又分為A1、A2基因亞型,B基因型內又分為B1、B2基因亞型。本研究測定的HMPV SY0702M13、SY0711M06、SY0711F09 均位于 B1 基因亞型分枝內,與日本HMPVJPS03-194最接近(圖1)。因此,本研究中檢出的為HMPV B1基因亞型。

3 討論

圖1 人偏肺病毒核蛋白基因系統進化分析?:Sequences of nucleoprotein genes of human metapneumoviruses in this study； A,B:genotype； A1,A2,B1,B2:subgenotype；The GenBank sequence number and the country of origin in parentheses；The Bootstrap value is set to 1 000Fig.1 Phylogenetic analysis of nucleoprotein genes of human metapneumoviruses

HMPV屬于副粘病毒科(Paramyxovirinae)肺病毒亞科(Pneumovirinae)偏肺病毒屬(Metapneumovirus),有A、B兩個基因型,A基因型內有A1、A2基因亞型,B基因型內有B1、B2基因亞型,是世界范圍內引起兒童ARI的重要病原體［10］。國內持續在兒童ARI患者中檢出HMPV,證實HMPV在國內分布范圍較廣,是國內兒童ARI的重要病原體［7-9］。HMPV主要侵犯5歲以內的低齡兒童,感染無性別差異,主要在當年10月份到第2年5月期間流行,但是因地域不同而在流行期限和流行高峰期上有所不同［10］。此次檢出HMPV的3份標本中1份來自2月份的兒童ARI患者,2份來自11月份的兒童ARI患者,3名患兒年齡都低于3歲。

首都兒科研究所對2002年11月到2003年3月采集的247份排除常見呼吸道病毒所致ARI住院患兒鼻咽洗液標本進行HMPV N基因擴增,有74份標本檢出HMPV,檢出率30%［11］；上海市兒童醫院對2004年8月到2005年1月采集的259份排除常見呼吸道病毒所致ARI住院患兒鼻咽洗液標本進行 HMPV M基因擴增,有59份標本中檢出HMPV,檢出率22.8%［12］。此次在2017年全年采集的100份沒有提前排除過常見呼吸道病毒感染的ARI住院患兒鼻咽洗液標本中有3份檢出HMPV,檢出率3%。首都兒科研究所、上海市兒童醫院的ARI住院患兒HMPV檢出率較高,推測與標本采集時間集中于HMPV流行期及提前排除常見呼吸道病毒感染有關。

國內北京、上海、深圳、湖南的研究數據顯示A、B基因型HMPV在當地同時流行,湖南研究數據顯示當地流行的 HMPV有 A1、A2、B1、B2基因亞型［11-14］。本研究顯示兒童居住地區存在B1基因亞型HMPV,未檢出其他基因亞型HMPV,有待進一步擴大研究。在HMPV流行高峰期內RSV、流感病毒等其它病原體引起的呼吸道感染也處于高發期,HMPV引起的兒童ARI癥狀多樣,和RSV、流感病毒等其它病原體引起的呼吸道感染的鑒別診斷比較困難［15］。因此,兒童ARI診斷中應注意 HMPV感染因素。HMPV感染尚缺乏有效的治療和預防方法,開展HMPV感染治療的研究,發展HMPV疫苗都已經成為當前HMPV研究的重點。

利益沖突:無