促離子型谷氨酸受體在正常大鼠下丘腦視前區的表達*

謝爽 孫燕泥 徐潤 唐雅雪 袁平 夏歡 楊明 楊鎧瑞 唐瑜

(1.合江縣人民醫院檢驗科，四川 合江 646200；2.成都醫學院檢驗醫學院； 3.成都醫學院臨床醫學院；4.成都醫學院生理學教研室，四川 成都 610500)

下丘腦視前區(Preoptic area，POA)是維持哺乳動物體溫恒定的重要中樞調節部位，視前區分布的溫度敏感神經元通過控制皮膚血管收縮、棕色脂肪組織產熱和戰栗產熱，參與體溫調節活動[1-3]。研究發現下丘腦存在局部的谷氨酸能神經環路[2,4,5]，谷氨酸作為中樞神經系統一種重要的興奮性神經遞質參與了體溫調節[6-8]。促離子型谷氨酸受體屬于配體門控離子通道，廣泛分布在神經元突觸后膜，介導快興奮性突觸傳遞，主要包括N-甲基-D-門冬氨酸(N-methyl-D-aspartate receptors，NMDARs)受體和α-氨基-3-羥基-5-甲基異惡唑-4-丙酸(alpha-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionic acid receptors, AMPARs)受體。NMDA受體包括NR1、NR2和NR3三個亞基，分別由GRIN1、GRIN2A-D和GRIN3A-B基因負責編碼；作為一種異四聚體，一般由兩個NR1亞基和兩個NR2亞基組成，較少含有NR3亞基，其中NR1亞基作為NMDA受體的功能亞單位，對于維持NMDA受體的功能非常重要[9,10]。AMPA受體也是一種同/異四聚體，由GluR1-4四個亞基組成，其中GluR2亞基存在mRNA Q/R位點編輯，帶正電的R(精氨酸)取代Q(谷氨酰胺)，使AMPA受體對鈣離子具有較低的通透性，所以GluR2亞基在AMPA受體中的相對表達決定AMPA受體的功能特性[11,12]。整體動物實驗發現，激活視前區中樞AMPA受體可以升高體溫[13]，而阻斷中樞谷氨酸促離子型受體，可以抑制外周注射精氨酸加壓素引起的低溫反應[14]。電生理實驗在大鼠視前區溫度敏感神經元上記錄到了興奮性突觸活動[15]，抑制這些突觸傳遞，可以影響視前區溫度敏感神經元的放電和溫度敏感性，從而調節體溫[16,17]。但是這些介導視前區神經元興奮性突觸傳遞的促離子型谷氨酸受體亞基尚不清楚。本實驗采用逆轉錄實時熒光定量PCR和Western blot技術鑒定成年SD大鼠視前區表達的促離子型谷氨酸受體亞基，為后續研究促離子型谷氨酸受體及其亞基在視前區神經元溫度敏感性形成機制和體溫調節中的作用奠定分子基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

1.1.2 主要試劑與抗體

RNAlater、Trizol由美國Invitrogen公司生產；DEPC為美國Sigma公司產品；PrimeScript RT reagent Kit、FastStart Essential Probes Master分別購自大連寶生物工程有限公司和Roche公司；RIPA裂解液、TEMED、PMSF為碧云天公司產品；BCA蛋白含量檢測試劑盒購于南京凱基公司；4 × loading buffer、蛋白Marker為美國Bio-Rad公司產品；ECL化學發光試劑盒購于Millipore公司；氯仿、異丙醇、甘氨酸、過硫酸銨、氯化鈉、戊巴比妥鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀，等均購自成都科龍化工試劑有限公司。兔抗鼠一抗GluR1(13185)、GluR2(5306)、GluR3(4676)購自美國CST公司；NR2A(AGC-002)、NR2B(AGC-003)為以色列Alomone公司產品；NR1(ab109182)、β-actin(ab8227)和辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗(ab6721)為Abcam公司產品。

1.1.3 主要實驗儀器與設備

熒光定量PCR儀(CFX Manager，美國Bio-Rad公司)、高速冷凍離心機(美國Thermo公司)、微量分光光度計(美國Thermo公司)、凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)、純水系統(成都超純科技有限公司)、電子天平(賽多利斯科學儀器有限公司)、干式恒溫微量恒溫器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)、酶標儀(美國Biotek公司)、振動切片機(德國徠卡公司)。

1.1.4 探針與引物

熒光定量PCR檢測目的基因所使用的探針選自瑞士Roche公司探針庫(UPL Probes)，所需引物為該探針庫所匹配設計的特異引物(表1)。探針成品購自Roche公司，引物由成都梓熙擎科生物技術公司合成。

表1 目的基因探針及引物序列

1.2 方法

1.2.1 取材

腹腔注射4%戊巴比妥鈉(1 ml·Kg-1)麻醉大鼠，開顱取腦后在0.1% DEPC處理過的冰PBS液中修塊，制備含有視前區的腦組織。用振動切片機切成300 μm厚的下丘腦片，在解剖顯微鏡下剝離視前區組織，迅速置于裝有1 ml RNAlater的EP管中。4℃過夜，-20℃保存備用。

1.2.2 逆轉錄實時熒光定量PCR

1.2.2.1 總RNA提取

將保存于RNAlater的組織塊用無酶鑷子轉移至1 ml Trizol中，嚴格參照Trizol試劑說明書操作，獲得總RNA并溶解于15 μl無RNA酶水中，使用紫外分光光度計測定RNA濃度及純度，A260/280=1.8～2.0。1%甲醛變性瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測RNA完整性，可見明亮的28S、18S及5S 3條帶，無DNA污染條帶。

1.2.2.2 cDNA合成

首先去基因組DNA，反應體系為：5×gDNA Eraser Buffer 2 μl，gDNA Eraser 1 μl，總RNA 2 μg，加無酶水至總體系為10 μl，混勻離心后轉至PCR儀，42℃孵育2 min；然后在體系內加入10 μl的逆轉錄預混液，該預混液含：PrimeScript RT Enzyme Mix I 1 μl，RT Primer Mix 4 μl，5×PrimeScript Buffer24 μl，RNase Free dH2O 1 μl。混勻離心后在PCR儀內反應：37℃ 15 min，85℃ 5 sec。

1.2.2.3 熒光定量PCR檢測目的基因mRNA表達

10 μl反應體系：FastStart Essential Probes Master 5 μl，引物及探針各0.15 μl，2 μl cDNA，加無酶水定容為10 μl。擴增程序：95℃預變性10 min；然后95℃10 sec，60℃30 sec，讀取熒光值，循環45次；最后40℃延伸30 sec。分別檢測目的基因和β-actin mRNA的臨界循環數(threshold cycle，Ct)，每個樣品均作復孔。以β-actin為內參，使用相對定量法計算各樣本ΔCt(目的基因Ct值-內參基因Ct值)，表示目的基因mRNA相對表達。ΔCt值越低，說明mRNA的量越多。

1.2.3 Western blot

組織塊按1 g：5 ml加入裂解液(RIPA：PMSF=100：1)，電動勻漿后置于冰上裂解30 min，隨后4 ℃ 13000 g 10 min離心，取上清至新的預冷的EP管中。嚴格按照BCA試劑說明書進行蛋白定量，以100 μg為標準分裝樣品，加入5 μl 4×loading buffer，定容為20 μl，渦旋震蕩混勻，100℃恒溫加熱10 min。將樣品進行SDS-PAGE，使用4℃過夜的10%凝膠，電泳100 V 20 min，120 V 80 min；根據蛋白Marker指示，切下相應范圍的膠條，轉膜，4℃ 200 mA 90 min。5%脫脂奶粉37℃封閉5 min，一抗(兔抗鼠)4 ℃震蕩過夜(NR2A、NR2B、NR1、GluR1、GluR2、GluR3 1：400，β-actin 1：5000)，TBST洗膜3次，10 min/次，二抗(1：5000)37℃震蕩2 h，TBST洗膜3次，10 min/次。用凝膠成像分析系統分析結果，計算條帶的積分光密度值(IOD)。實驗結果以目的蛋白相對表達量(目的蛋白IOD/內參IOD)表示。

1.3 數據處理

本文所有數據均以Mean±SE表示，用SPSS 17.0軟件進行統計分析。采用One-Way ANOVA檢驗比較樣本間均數，方差齊則采用Dunnet t檢驗，方差不齊則采用Tamhane′s T2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠視前區NMDA受體和AMPA受體亞基mRNA的表達

如表2所示，視前區存在NMDA受體亞基Nr2a、Nr2b和Nr1 mRNA的表達，同時AMPA受體亞基表達Glur1、Glur2和Glur3 mRNA，但沒有檢測到Glur4。與Nr1 mRNA相比，Nr2a(P<0.01)、Glur1(P<0.05)和Glur3(P<0.05)的mRNA表達顯著降低，而Nr2b和Nr1 mRNA的表達無統計學差異(P>0.05，表2)。與Glur2 mRNA相比，Nr2a(P<0.01)、Nr2b(P<0.05)、Glur1(P<0.01)和Glur3(P<0.01)mRNA的表達減少，且有統計學意義，但是Glur1和Glur3 mRNA的表達無統計學差異(P>0.05)。這些結果說明大鼠視前區NMDA受體亞基主要表達Nr2b和Nr1 mRNA，AMPA受體亞基表達mRNA以Glur1、Glur2、Glur3主，且Glur2表達最高。

2.2 大鼠視前區NMDA受體和AMPA受體亞基蛋白的表達

如圖1A所示，視前區存在NMDA受體亞基NR2A、NR2B、NR1和AMPA受體亞基GluR1、GluR2、GluR3蛋白表達。NMDA受體亞基蛋白NR2A與NR1相比表達明顯較少(P<0.05)；NR2B表達雖然較高，但和NR1蛋白表達比無統計學差異(P>0.05，圖1B)。AMPA受體亞基GluR1和GluR3蛋白相對表達高于GluR2，但只有GluR3的表達差異有統計學意義(P<0.05)。同時GluR1、GluR2、GluR3和NMDA受體亞基蛋白NR1的表達相當(P>0.05)，而NMDA受體亞基蛋白NR2A明顯低于AMPA受體亞基蛋白GluR2(P<0.01)，NR2B的表達正好相反(P>0.05)。這些結果說明大鼠視前區NMDA受體亞基主要表達NR2B和NR1蛋白，AMPA受體亞基蛋白主要表達GluR1、GluR2、GluR3，且GluR3表達最高。

圖1 大鼠視前區NMDA受體和AMPA受體亞基蛋白表達A：Western blot檢測大鼠視前區NMDA受體亞基(NR2A、NR2B、NR1)和AMPA受體亞基(GluR1、GluR2、GluR3)表達的代表蛋白條帶，β-actin為內參蛋白；B：NMDA受體亞基(NR2A、NR2B、NR1)和AMPA受體亞基(GluR1、GluR2、GluR3)蛋白相對表達量(目的蛋白/β-actin)。與NR1亞基蛋白相比，*P<0.05；與GluR2亞基蛋白相比，△P<0.05，△△P<0.01，n=6。1，2分別代表1號和2號大鼠。

目的基因Ct目的基因β-actin△CtNMDA受體Nr2a亞基31.51±0.3115.22±0.0816.40±0.31**△△NMDA受體Nr2b亞基23.32±0.0415.22±0.088.20±0.04△NMDA受體Nr1亞基22.98±0.4615.22±0.087.87±0.46AMPA受體Glur1亞基24.78±0.5115.22±0.089.67±0.51*△△AMPA受體Glur2亞基22.72±0.1915.22±0.087.61±0.19AMPA受體Glur3亞基25.09±0.4415.22±0.089.98±0.44**△△

與Nr1亞基mRNA相比較，*P<0.05，**P<0.01；與Glur2亞基mRNA相比較，△P<0.05，△△P<0.01。

3 討論

下丘腦視前區參與體溫調節[1-3,18-20]，分布的溫度敏感神經元既可以感受局部溫度變化，又可以接受外周傳入的溫度信號，故其放電活動受到突觸傳遞的調制作用[20,21]。視前區溫度敏感神經元可以控制機體的產熱(冷敏神經元興奮)和散熱(熱敏神經元興奮)活動，這提示突觸傳入可以通過影響視前區溫度敏感神經元的放電調節體溫。研究發現皮膚溫度信號上傳到下丘腦正中視前核的谷氨酸能中間神經元，然后傳入到內側視前區，視前區熱敏神經元接受正中視前核的谷氨酸能突觸傳入后，調制視前區熱敏神經元的放電活動[2-5]。這說明影響視前區溫度敏感神經元活動的突觸傳遞可能與激活谷氨酸受體有關。整體動物實驗發現，阻斷中樞促離子型谷氨酸受體而不是促代謝型受體后，大鼠腹腔注射精氨酸加壓素引起的低溫反應消失[14]，而直接激活視前區AMPA受體可明顯升高動物體溫[13]。

中樞主要的谷氨酸促離子型受體包括NMDA受體和AMPA受體，廣泛分布在許多類型的神經元上，尤其是突觸后膜。作為典型的配體門控離子通道，介導興奮性的快突觸傳遞活動，在調節神經元的放電頻率，放電模式，參與形成學習與記憶等方面均有重要作用。哺乳動物神經元上NMDA受體存在NR1、NR2和NR3三個亞基，作為一種異四聚體，一般由兩個NR1亞基和兩個NR2A-D亞基組成，較少含有NR3亞基，其中NR1亞基作為NMDA受體的功能亞單位，對于維持NMDA受體的功能非常重要[9,10]。AMPA受體是由GluR1-4四個亞基組成的同/異四聚體，其中GluR2亞基決定AMPA受體對鈣離子具有較低的通透性，它的相對表達決定AMPA受體的功能特性[11,12]。所以，在本實驗中我們將NR1、GluR2 mRNA和蛋白表達分別作為對照進行比較，并且用這兩亞基的表達分別代表NMDA受體和AMPA受體的功能。

采用qRT-PCR技術，在所有6只大鼠視前區都檢測到了Nr2a、Nr2b、Nr1、Glur1、Glur2和Glur3 mRNA，但沒有檢測到Glur4 mRNA。這也和文獻報道相一致，含有GluR4亞基的AMPA受體通常表達在大鼠幼年期，而在成年大鼠主要表達由GluR1、GluR2、GluR3組成的AMPA受體[9,10]。相對定量顯示，在視前區Nr2amRNA表達明顯低于Nr1，而Nr2b和Nr1 mRNA表達基本相當；Glur1、Glur3 mRNA表達也明顯低于Glur2。采用Western blot技術，在所有6只大鼠視前區都檢測到了NR2A、NR2B、NR1、GluR1、GluR2和GluR3亞基蛋白表達。相對定量結果顯示，視前區NMDA受體亞基蛋白表達趨勢與mRNA相一致，NR2A明顯低于NR1，NR2B和NR1表達基本相當。這說明視前區NMDA受體的構成以NR1/NR2B為主，而不是NR1/NR2A。這不同于以往的報道[15]，成年大鼠皮層、海馬以NR2A表達為主，且突觸上的NR2B蛋白表達具有年齡依賴性，海馬CA1、CA3區NR2B蛋白在出生時達到最高峰，7天后逐漸降低。海馬NR2B蛋白表達的變化與突觸可塑性密切相關，參與了長時程增強的形成[16]。NR2B亞基mRNA表達的變化可能引起腦缺血再灌注后細胞的凋亡[17]。但在視前區NMDA受體構成以NR1/NR2B為主有何生理意義，其如何參與體溫調節活動，還有待于進一步研究證實。有趣的是視前區AMPA受體亞基蛋白表達與mRNA并不一致，GluR1和GluR2表達水平相當，GluR3表達高于GluR2。這有可能與GluR3蛋白表達升高后，通過負反饋調節抑制其mRNA表達有關。一般在動物神經元上GluR2亞基高表達，這決定了AMPA受體對鈣離子較低的通透性[12]，從而保護神經元避免鈣超載的發生。本實驗中，無論是mRNA還是蛋白表達，NR1和GluR2均無統計學差異，而NR1是NMDA受體的功能亞基[9,10]，這提示在視前區NMDA受體和AMPA受體從表達上來看，其功能作用大體相當。

綜上所述，本實驗從基因轉錄和蛋白質水平證實，在正常大鼠視前區存在促離子型NMDA受體和AMPA受體的表達，其主要亞基分別為NR1/NR2B、GluR1-3，但從受體功能上看兩種促離子型谷氨酸受體表達沒有差異。這將為后續研究促離子型谷氨酸受體及其亞基在視前區神經元溫度敏感性形成機制和體溫調節中的作用提供實驗依據。