Toll樣受體9基因多態性與湖北漢族系統性紅斑狼瘡易感性的關系

邢亞瓊 吳雪菁子 宋繼權

系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus, SLE)是一種慢性進行性自身免疫性疾病，常累及人體多個器官及系統，預后較差[1]。SLE病因復雜，經大量研究顯示與遺傳、環境、內分泌、感染等各種內外因素均相關[2]，但一般認為其他因素均是在遺傳因素異常的基礎上發生，遺傳因素在疾病的易感性和臨床表現上起著不可替代的作用。因此，在研究SLE易感性時，對人體全基因組易感基因位點的分析不容忽視。SLE的致病機制與以B淋巴細胞的活化、增值、功能亢進為中心的體液免疫及細胞免疫紊亂息息相關[3]。Toll樣受體(TLRs)是一種識別先天免疫模式的蛋白質家族。它們廣泛地表達在人體的各種組織和細胞中，并且能夠識別并結合保守的病原體相關分子，繼而觸發一系列的信號轉導通路，導致炎癥介質的釋放，從而激活獲得性免疫。TLRs被認為是先天免疫和后天免疫之間的橋梁[4]。日本學者Hemmi等[5]在2000年通過BLAST搜索、實驗等首次發現TLR9。隨后相繼有研究證實B淋巴細胞僅表達TLR9和TLR10。其中，TLR9通過與DNA中胞嘧啶磷酸鳥苷基因序列(CPG DNA)特異性結合進而激活免疫細胞B淋巴細胞并使其快速增殖，產生大量抗雙鏈DNA抗體；同時調控獲得性免疫應答，產生多種細胞因子[6,7]。綜上可見TLR9在SLE發病中發揮著重要作用。然而，查閱近年來的文獻，發現對TLR9基因多態性與系統性紅斑狼瘡相關性的研究報道數量并不多，且統計結果缺乏一致性[8-11]。因此，本文通過對人外周血DNA測序分析在湖北漢族人口中Toll樣受體9基因多態性(rs187084、rs352140)與SLE的相關性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 80例SLE患者資料收集于2015年6月至2017年12月武漢大學中南醫院及湖北省人民醫院門診及住院部患者，均為湖北漢族女性，平均年齡為36歲。納入標準符合1997年美國風濕協會修訂的SLE診斷標準。健康對照組84人，收集于我院體檢中心，各項檢查指標均正常的人群，平均年齡為32歲，且排除了SLE、類風濕性關節炎、皮肌炎等自身免疫性疾病及相關家族史。所有研究對象間均無血緣關系。本研究已通過武漢大學中南醫院倫理委員會批準，并在實施過程中遵守赫爾辛基宣言，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 儀器與試劑 5424臺式離心機(Eppendorf公司)，S1000 Thermal Cycler PCR儀(美國BIO-RAD公司)，DYY-6C電泳儀(北京六一儀器廠)，Tanon1600凝膠成像系統(上海天能科技有限公司);2xTsingKe Master Mix(武漢擎科創新生物科技有限公司)，血液基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司DP318)。

1.3 實驗方法 收集受試者清晨空腹靜脈血5 mL于EDTA紫色抗凝管中于4℃保存。采用苯酚-蛋白酶K法提取外周血基因組DNA，采用紫外分光光度計測定DNA含量及濃度，A260/A280>1.8，并于-20℃保存。選取并合成位于rs187084、rs352140位點的目的基因合成引物，合成引物(見表1)由武漢擎科創新生物科技合成。擴增條件為：94℃預變性3 min，94℃變性30 s，56℃復性30 s，72℃延伸30 s，35次循環，72℃延伸5 min。將PCR產物經2%瓊脂糖凝膠(含溴乙啶)電泳，驗證擴增結果后由武漢擎科創新生物科技有限公司通過SNaPshot法測序。

1.4 統計學方法 采用直接計數法分別對實驗組和對照組進行等位基因和基因型頻率進行統計，用SPSS 21.0軟件進行χ2檢驗。SLE實驗組及正常對照組間的等位基因頻率及基因型頻率進行卡方檢驗分析，P<0.05為有統計學差異。

2 結果

2.1 Hardy-Weinberg平衡檢驗 分別對SLE實驗組及對照組各基因型的頻數及理論頻數進行H-W平衡檢驗，2個位點在兩組的分布均符合H-W平衡定律(P>0.05)，表明此次選取的樣品符合遺傳平衡定律，具有很好的代表性，可以代表總體人群。

2.2 基因型頻率及等位基因頻率 rs187084 AA,GG,AG基因型頻率在實驗組及對照組無顯著統計學差異(P>0.05)。A,G等位基因頻率在實驗組及對照組無顯著統計學差異(P>0.05)。rs352140 AA,GG,AG基因型頻率在實驗組及對照組無顯著統計學差異(P>0.05)。A,G等位基因頻率在實驗組及對照組無顯著統計學差異(P>0.05)。見表2、圖1。

表1 PCR擴增引物序列

表2 rs187084、rs352140位點基因型及等位基因在實驗組與對照組間的分布 例(%)

a b c d e f

注：a、b、c為rs352140位點測序結果，基因型分別為AG、AA、GG；d、e、f為rs187084位點測序結果，基因型分別為AG、AA、GG

圖1 基因測序圖

3 討論

SLE的發病機制及病因并不十分明確。然而統計發現SLE有家族聚集性，且同卵雙生子與異卵雙生子的發病率不同。眾多研究者經全基因組關聯分析(Gemone wide associated studies，GWAS)發現超過60個與SLE相關的易感基因位點，其中一些基因位點對早期B細胞的發育及B細胞表面受體的信號傳導有重要影響[12,13]，表明遺傳因素在SLE的發生及發展中起到了一定的作用。另有研究者將SLE患者功能障礙的間充質干細胞(mesenchymal stem cell，MSC)在體外培養仍顯示免疫調節功能受損，然而基因敲除候選易感基因后，MSC相應的功能恢復[14,15]，由此進一步證實了遺傳因素與SLE的相關性。

TLR9在自身免疫性疾病發病機制中的作用得到了人們越來越多的關注。TLR9是toll樣受體家族中的重要一員，主要表達于漿細胞樣樹突狀細胞(pDC)、記憶性B細胞等免疫細胞[16]。一直以來，人們認為TLR9僅能與細菌、病毒等微生物中的DNA胞嘧啶磷酸鳥苷基因序列(CPG DNA)形成的配體結合。近來，研究者們陸續發現人類真核細胞線粒體DNA(mtDNA)中保留著類似細菌DNA的分子序列，其中不被甲基化修飾的CPG序列可以作為TLR9的配體，經結合后作用于免疫細胞，繼而誘導免疫應答[17]。也有研究證實，SLE患者體內凋亡和/或清除缺陷的血漿DNA與自身抗體結合形成的免疫復合物結合pDCs表面的FcγRIIa,繼而與胞內的TLR9結合，刺激pDCs釋放干擾素IFN-α，激活pDCs更高效的對自身反應性T淋巴細胞進行抗原提呈。同時免疫復合物在BCR/TL9的參與下激活B淋巴細胞，導致B淋巴細胞產生大量自身抗體。這些自身抗體又參與了免疫復合物的形成，產生的免疫復合物又可以充當TLR9的激動劑從而繼續下一個循環[18-21]。Chow等[22]通過小鼠動物實驗發現TLR9是toll樣受體9/轉化生長因子β1/血小板源性生長因子B(TLR9/TGF-β1/PDGF-B)通路的重要角色，介導骨髓巨噬細胞的一種信號級聯反應。隨后Yuan等[23]為探討TLR9/TGF-β1/PDGF-B通路在SLE患者原代細胞中的是否存在，及與健康人群是否存在差異，實驗發現CpG序列可誘導SLE患者細胞中TGF-β1mRNA和PDGF-BmRNA水平明顯高于健康人群組。有研究說明TLR9在TLR9/TGF-β1/PDGF-B炎癥通路中扮演著重要角色，并且與SLE相關。Liu等[24]將表達Epstein Barr病毒膜抗原BLLF1的21只轉基因雌性小鼠隨機分為空白對照組、B淋巴細胞刺激因子(BLYS)抑制組和TLR-9抑制組，持續治療10天后，采集外周靜脈血，檢測TLR-9 mRNA的相對水平，BLYS和IL-10蛋白濃度水平，結果發現BLYS抑制與TLR9抑制組比較，TLR9 mRNA和BLYS蛋白濃度這兩項指標的差異有統計學意義(P<0.05)，由此推測TLR9及其相關的信號通路可能對BLYS誘導的SLE和炎癥免疫水平的調節有重要意義。Benigni等在實驗中發現在狼瘡性腎炎小鼠模型中TLR9與尿蛋白及腎小管損傷程度正相關，并認為可以通過外周B細胞TLR9的表達情況作為判斷SLE患者疾病活動性及臨床預后的指標[25-28]。以上這些研究及相關發現提示TLR9不僅參與免疫應答，并且在系統性紅斑狼瘡致病的相關炎癥通路中發揮著至關重要的作用。

遺傳，對決定疾病的易感性及臨床表型起著關鍵作用，這是不可否認的事實。近年來研究表明TLR9多個單核苷酸多態性(SNP)位點的基因多態性參與了多種疾病的發生發展過程，包括腫瘤性疾病、感染性疾病、免疫相關性疾病等[29,30]。人類TLR9基因位于3號染色體p21.3,是SLE的易感基因位點之一，在TLR9的單核苷酸多態性基因位點中，rs187084位于啟動子區，rs352140位于第2個外顯子區，故其多態性可能影響TLR9的功能，參與SLE疾病的發生、發展。Huang等[8]研究發現rs187084基因多態性，與臺灣系統性紅斑狼瘡病人相關。Tao等[9]研究發現rs352140位點基因多態性與中國人口中系統性紅斑狼瘡的易感性相關。然而，有研究發現在韓國SLE患者中TLR9基因多態性與系統性紅斑狼瘡無相關性[10]。Piotrowski等[11]在波蘭籍人群中隨機抽取254例系統性紅斑狼瘡患者及521例健康志愿者，檢測其外周血中TLR9 的rs352140位點基因多態性，結果無統計學差異。綜上說明，目前對Toll樣受體9基因層面的研究較少，且研究結果不一致。

本次研究中為探究TLR9基因位點多態性與湖北漢族人群系統性紅斑狼瘡的疾病易感性的關系，我們通過觀察80例系統性紅斑狼瘡患者和84名健康對照，選擇2個SNP位點(rs187084、rs352140),采用SNaPshot方法對DNA樣本SNP位點進行分析，結果顯示 rs187084、rs352140位點基因型頻率和等位基因在實驗組和對照組中均無顯著統計學差異(P>0.05)。本實驗結果提示可能上述兩個SNP位點與SLE的發病機制不相關。

本次實驗初步探討了TLR9基因多態性與SLE疾病易感性的關系。結果提示rs187084、rs352140位點的單核苷酸多態性與湖北漢族系統性紅斑狼瘡的易感性可能不相關。另外，本實驗在TLR9的基因位點中僅選擇了2個位點，不排除其他位點在實驗組及對照組中表達有差異的可能。同時本次實驗中選取的樣本量小，地域范圍較局限，故在基因層面還有待于進一步探討。