遼寧省雞源沙門氏菌血清型與耐藥性分析

田曉玲，韓鐫竹，李欣南，高鐸，武鳳嬌

（遼寧省獸藥飼料畜產品質量安全檢測中心，遼寧 沈陽 110016）

沙門氏菌（Salmonella）屬腸桿菌科，革蘭氏陰性腸道桿菌[1]。沙門氏菌（Salmonellosis）病是指由各種血清型的沙門氏菌所引起的對人類、家畜以及野生禽獸不同形式的總稱[2]，沙門氏菌屬有的專對人類致病，有的只對動物致病，也有對人和動物都致病[3]。雞沙門氏菌可引起雞白痢、雞傷寒和禽副傷寒，具有垂直傳播和水平傳播的特點，是嚴重危害家禽業的重要致病菌[4-6]。沙門氏菌的抗原主要分為3種類型：菌體O抗原、鞭毛或菌毛H抗原、莢膜Vi抗原[7-8]。沙門氏菌有2 535個血清型，我國已檢出292個血清型[9-10]，全世界已確認其中腸炎沙門氏菌能夠在禽類及其產品中穩定傳播[11-12]。從國內外的研究情況來看，沙門氏菌的檢出率不斷上升，耐藥性逐漸加強[13-15]。本文借鑒生化分離鑒定方法，通過分析遼寧省養殖場雞源沙門氏菌的耐藥性變化趨勢，為臨床沙門氏菌應用提供參考，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 質控菌株為ATCC14028，購自北京蘭伯瑞生物技術有限責任公司；試驗菌株于養殖場（戶）采集。

1.2 儀器生物安全柜CLASSⅡ（美國NUAIRE公司）；全自動高壓滅菌器（日本三洋電器集團）；恒溫培養箱（德國BINDER公司）；ABT Expression鑒定儀（BIOMERIEUX公司）。

1.3 培養基與材料 緩沖蛋白胨水培養基、SC培養基、DHL培養基、SWARM瓊脂和營養瓊脂購自北京陸橋技術有限責任公司；沙門氏菌顯色培養基購自上海欣中生物工程有限公司；API NaCl 0.85%培養基和ID32E鑒定條均購自BIOMERIEUX公司；腸桿菌藥敏檢測板購自天津市金章科技發展有限公司；O多價血清、O單價血清、抑制劑、H多價血清和H單價血清購自泰國S&A公司。

1.4 方法

1.4.1 分離純化采集新鮮雞盲腸樣品，直接放入緩沖蛋白胨水培養基中，36±1℃培養18 h。吸取預增菌培養物10 mL接種于SC培養基36±1℃培養48 h。將選擇性增菌液劃線接種于DHL培養基上36±1℃培養24 h。挑取黑色疑似菌落劃線接種于沙門氏菌顯色培養基上36±1℃培養24 h，生長出的粉色菌落為疑似單菌落。

1.4.2 生化鑒定將上述獲得的疑似單菌落，在營養瓊脂平板上劃線36±1℃培養24 h。將待檢細菌單個菌落，懸浮于3 mL懸浮培養基，制備0.5麥氏濃度的菌懸液，使用自動加樣器將菌懸液滴入試紙條反應杯中，每個反應杯中滴入55 μL，菌液和試劑滴加完畢后，37℃培養24 h，用細菌鑒定儀判讀。

1.4.3 血清型鑒定用接種針挑取適量菌苔，在SWARM培養基中間點一點，37℃正向培養16～18 h。在蓋玻片上滴加7 μL血清，挑取少量菌苔與血清混勻，10～30 s后在日光燈下觀察凝集反應，凝集為陽性，渾濁或澄清為陰性。分別判斷營養瓊脂上和SWARM上的沙門氏菌的O抗原和H抗原類型，查閱White-Kauffmann抗原表，確定沙門氏菌的血清型。

1.4.4 藥物敏感性試驗 用接種環挑取營養瓊脂平板上培養1～18 h的3～5個單菌落，用無菌生理鹽水或M-H肉湯稀釋至0.5麥氏單位。取稀釋至5×105CFU/mL濃度的菌液0.1 mL分別加入含系列抗菌藥物溶液的板中，混勻，試管中最終抗菌藥物的濃度為原稀釋濃度的一半。將加有菌液和抗菌藥物的板，置37℃培養箱中培養20～24 h。取出培養后的板，觀察結果，以無菌生長的最低抗菌藥物溶液的濃度為最低抑菌濃度（MIC）。在質控菌株的最低抑菌濃度符合規定范圍的前提下，按判斷標準判斷被檢菌株的敏感性：敏感（S）、中度敏感（I）或耐藥（R），判定標準參照美國臨床實驗室標準化委員會（CLSI）標準。

2 結果與分析

2.1 分離純化結果采集了遼寧省4個養殖場的雞盲腸共632份樣品，分離鑒定得到131株沙門氏菌，分離率為20.73%。DHL培養基上無色半透明有黑色中心或幾乎全為黑色，有些菌株無色半透明為疑似單菌落，結果見圖1。沙門氏菌顯色培養基上菌落圓形、粉紅色，表面凸起濕潤，有光澤，邊緣整齊的菌落確定為陽性沙門氏菌，結果見圖2。

圖1 DHL培養基上沙門氏菌的生長形態Fig.1 The growth morphology of Salmonella on DHL medium

圖2 顯色培養基上沙門氏菌的生長狀態Fig.2 The growth state of Salmonella on the chromogenic medium

2.2 鑒定結果經細菌鑒定儀判讀后得到的沙門氏菌生化鑒定，與中國微生物菌種目錄給出的沙門氏菌一致，具體結果見表1。

2.3 血清型鑒定結果對131株雞源沙門氏菌分離株進行血清型鑒定并分群，結果如表2所示。

2.4 藥物敏感性試驗結果

2.4.1 沙門氏菌的耐藥率和MIC分布 根據藥敏試驗結果，將最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）分布列于表3。

表 1 沙門氏菌生化鑒定譜Table 1 Biochemical identification spectrum of Salmonella

表 2 遼寧省雞源沙門氏菌分離株血清型分析表Table 2 Serotype analysis of Salmonella isolates from chickens in Liaoning

總體來說，沙門氏菌對9類測試抗生素普遍耐藥，只對頭孢類抗生素較為敏感，但總體耐藥率均較低，未超過70%耐藥，只有磺胺異噁唑的耐藥相對高一些，在60%以上，其余均在20%～40%之間波動。MIC也主要分布在敏感區域；但相對野生型菌株來說，沙門氏菌耐藥譜明顯右移，證明其已獲得耐藥基因，應引起高度的重視。

2.4.2 多重耐藥性狀況 本文中的多重耐藥均是以藥物類別來進行統計分析，具體數據見表4。沙門氏菌41.98%的分離株為3類及3類以上耐藥菌株；沙門氏菌25.95%的分離菌株對7類的藥物耐藥，未見全部耐藥菌株。

表 4 遼寧省雞源沙門氏菌多重耐藥率情況Table 4 Multidrug resistance rate of Salmonella in Liaoning chicken

3 討論

本文對遼寧省的雞源沙門氏菌進行了考察監測，分離出的沙門氏菌主要是腸炎沙門氏菌，與文獻報導的流行沙門氏菌一致[16]，雖然血清型種類繁多、菌株復雜，分布具有很強的區域特點，但以腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、印第安納沙門氏菌和德爾卑沙門氏菌等為主。

藥敏試驗表明分離獲得的沙門氏菌對獸醫臨床常用的多種抗菌藥物有耐藥率，但總體耐藥率均較低。王嘉煒等[17]研究表明，沙門氏菌對磺胺異噁唑（89.81%）耐藥最為普遍，對磺胺甲噁唑、萘啶酮酸、四環素、氨芐西林、氯霉素和阿莫西林-克拉維酸等抗生素的耐藥率均在50%以上。據WHO統計，全球每年有大約90%的抗生素用于食用動物的飼料添加劑和疾病的防治，其中以作為飼料添加劑為主，只有10%用于人類疾病的治療。這可能跟采樣的范圍有關，導致分離菌株數有限，代表性不夠，應擴大采樣范圍，增加采樣地區。同時，試驗中的采集的樣本均來自健康動物，耐藥率低是正常現象。