UPLC-MS-MS法檢測獸用中成藥中非法添加利巴韋林、阿昔洛韋和嗎啉胍的研究應用

張志遙

（遼寧省畜產品安全監察所，遼寧 沈陽 110003）

近年來隨著抗生素的濫用，動物機體耐藥性不斷升高，畜禽產品中抗生素殘留也時刻威脅著食品安全[1-2]。因此獸用中成藥憑借著其低毒副作用與不產生耐藥性的優勢，在市場中的越來越受到重視。但是，一些不法商家為提高療效并降低成本，在獸用中成藥中非法添加抗生素從而謀取暴利，嚴重擾亂市場秩序，危害動物食品安全[3-5]。本試驗中，以利巴韋林、阿昔洛韋和嗎啉胍3種典型的非法添加抗病毒藥物為研究對象，建立檢測這3種物質的高效液相色譜串聯質譜（UPLC-MS-MS）方法，以期為相關產品非法添加抗病毒類藥物的監督檢驗提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器 超高效液相色譜-串聯質譜儀，美國WATERS公司；Nanopure超純水系統，Thermo Scientific公司；海爾BCD-649WE雙開門冰箱，青島海爾集團；KQ 500超聲波提取儀，上海波龍電子有限公司；AG-285電子天平，METTLER TOLEDO公司；TDL 240離心機，上海安亭科學儀器廠；漩渦混勻器，鼎昊源科技有限公司；KQ-250DE型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 試驗藥品利巴韋林、阿昔洛韋、嗎啉胍，批號均為101116-201102，中國食品藥品檢定研究院；甲醇、甲酸，Across Organics公司；三乙胺（分析純），國藥集團化學試劑有限公司；乙腈（色譜純），賽默飛世爾科技中國有限公司；豐舒（荊防敗毒散）（100 g/袋）、黃連敗毒散（200 g/袋），均為市場隨機選購。

1.3 試驗方法

1.3.1 相關溶液的制備

1.3.1.1 標準溶液的配制準確稱量利巴韋林、阿昔洛韋、嗎啉胍3種藥物的標準品各10 mg于10 mL容量瓶中，加入甲醇溶液定容，顛倒混勻，濃度為1 mg/mL。取無非法添加的各制劑1 g，置于100 mL容量瓶中，用水充分溶解稀釋100倍。

1.3.1.2 陰性空白溶液的配制取無非法添加的各制劑1 g或1 mL，置于100 mL容量瓶中，用水充分溶解，超聲10 min，在添加至刻度處，來回顛倒數十次至充分混勻，接著再按照上述步驟稀釋100倍，作為陰性空白溶液。

1.3.1.3 待測樣本溶液的配制稱取藥品粉末1.00 g，緩慢加入50 mL離心管中，加10 mL乙腈，漩渦混勻，80 w超聲10 min。將超聲波后的溶液經濾紙過濾至潔凈燒杯中，用5 mL乙腈清洗濾紙上的殘渣，后將濾液轉移至100 mL容量瓶中，清洗定容待測。

1.3.2 質譜條件的確定由于阿昔洛韋、嗎啉胍（病毒靈）、利巴韋林均具有氨基，容易得到H+而形成較為穩定的[M+H]+準分子離子，所以首先確定正離子電離模式（ESI+），多反應監測方式（MRM）。參考相關文獻[6-8]以及對實際離子掃描結果的優化，確定阿昔洛韋、嗎啉胍（病毒靈）、利巴韋林監測離子對。

表1 質譜條件Table 1 Results of mass spectrometry conditions

其他質譜條件如下：毛細管電壓：1.0 KV；脫溶劑溫度：350℃；脫溶劑氣流量：800 L/h；錐孔氣流量：50 L/h。

1.3.3 液相條件的建立以50 mm×2.1 μm×1.7 μm的BEHC 18柱為分離柱，0.2%甲酸水溶液和乙腈為流動相，0.2 mL/min流速梯度洗脫，能夠將雜質峰分開，實際分離效果很好，詳細液相條件如表2。

1.3.4 定性方式的確定 本次試驗中每種組分的定性均采用保留時間和離子比率2個因素。

1.3.5 檢出限和定量限的確定將信噪比為3:1時的藥物濃度定為檢測限，將信噪比為10:1的時待檢測樣品中的濃度為定量限。

取1±0.2 g荊防敗毒散樣品，分別制備成一系列濃度的利巴韋林、阿昔洛韋、嗎啉胍陽性樣品，供液相色譜-串聯質譜儀測定。

1.3.6 標準添加曲線的建立將抗病毒類藥物標準品配成混合標準工作液，分別制成10、20、50、100、500和1 000 μg/L的標準品溶液，依次從低濃度到高濃度進樣，每濃度進樣2針，按其所得峰面積的平均值與對應的標準溶液濃度作標準曲線，并計算標準曲線的回歸方程和相關系數。

表2 液相梯度洗脫程序Table 2 Liquid phase gradient elution procedure

1.3.7 添加回收試驗取適量的荊防敗毒散樣本，根據10、20、40 μg/kg的比例分別添加利巴韋林、阿昔洛韋、嗎啉胍，配制成樣品溶液，送入機器中進行檢測。每個藥品需要進行6次平行檢測，記錄檢測結果。

1.3.8 精密度與準確度相對標準偏差（RSD）=標準偏差（SD）/計算結果的算術平均值（X）×100%。

1.3.8.1 精密度取空白樣品荊防敗毒散18份，每份稱取1.00±0.02 g，分別加入100.0 μg/L的混合標準工作液100.0、200.0、500 μL，制成低、中、高3個濃度（溶液濃度分別為10.0、20.0、50.0 μg/kg）的質量控制（QC）樣品，每一濃度6樣本分析，計算QC樣品的測得濃度。

1.3.8.2 準確度取適量的混合標準工作液，配制成10 μg/L，重復測定濃度10.0 μg/L的混合標準工作液6次，通過峰面積的平均值和標準差求得變異系數，記錄并計算試驗結果。

1.3.9 測定低限添加回收分別取空白樣品荊防敗毒散、黃連敗毒散2份，每份稱取1.00±0.02 g，分別加入100.0 μg/L的混合標準工作液100 μL，制成濃度為10 μg/kg的質量控制（QC）樣品，進行平行樣品分析，計算QC樣品的測得濃度，根據QC樣品測定結果計算本法的回收率。

1.3.1 0穩定性試驗檢測按照方法要求，取1±0.2 g空白樣品荊防敗毒散樣品，制備成含量為40 ppb的利巴韋林、阿昔洛韋、嗎啉胍樣品，連續3 d進行檢測。

1.3.1 1檢測方法的應用試驗方法確立后，于市場中隨機抽檢36種抗病毒類中成藥應用試驗確立方法進行結果檢測。

2 結果與分析

2.1 檢出限和定量限的確定結果結果表明，10 μg/kg的利巴韋林樣品，其檢測圖譜定量離子的信噪比總能大于3以上；20 μg/kg的利巴韋林樣品，其信噪比在10以上，且其圖譜清晰，分離效果較好，所以將利巴韋林檢出限和定量限分別定為10 μg/kg和20 μg/kg。用同樣方法確定阿昔洛韋的檢出限和定量限分別為10 μg/kg和20 μg/kg，嗎啉胍（病毒靈）的檢出限和定量限分別為10 μg/kg和20 μg/kg。

2.2 標準添加曲線檢測結果結果表明，利巴韋林標準曲線在10～1 000 μg/L范圍內線性關系很好，相關系數均在0.99以上，利巴韋林的線性方程為：A=58.69C+3616.04；阿昔洛韋標準曲線在10～1 000 μg/L范圍內線性關系很好，相關系數均達到0.99以上，阿昔洛韋的線性方程為：A=557.384C+96.8.76；嗎啉胍標準曲線在10～1 000 μg/L范圍內線性關系很好，相關系數均達到0.99，嗎啉胍的線性方程為：A=135.735C+2400.12。以上符合確證試驗相關要求。結果見表3和圖1。

表3 抗病毒類藥物標準曲線結果表Table 3 Standard curve of Antiviral drugs during method

圖1 利巴韋林、阿昔洛韋、嗎啉胍標準品圖譜Fig.1 Standard atlas of Ribavirin,acyclovir,morpholine

2.3 添加回收試驗結果對分別添加10、20、40 μg/kg利巴韋林的荊防敗毒散樣品進行6平行檢測，測得平均回收率分別為105.50%、111.75%、98.67%。對分別添加10、20、40 μg/kg阿昔洛韋的荊防敗毒散樣品進行6平行檢測，測得樣品中平均回收率分別為105.17%、106.75%、116.75%。對分別添加10、20、40 μg/kg嗎啉胍的荊防敗毒散樣品進行6平行檢測，測得樣品中平均回收率分別為87.91%、86.25%、107.19%。

2.4 精密度檢測結果試驗結果表明，10 μg/kg的利巴韋林、阿昔洛韋與嗎啉胍的相對標準偏差分別為18.53%、4.46%和2.49%；20 μg/kg的利巴韋林、阿昔洛韋與嗎啉胍的相對標準偏差分別為1.65%、0.69%和1.27%；50 μg/kg的利巴韋林、阿昔洛韋與嗎啉胍的相對標準偏差分別為1.87%、1.21%和0.55%；據QC樣品測定結果計算本法的精密度，均小于20%。結果見表4。

2.5 準確度檢測結果重復測定濃度10.0 μg/L的混合標準工作液6次，通過峰面積的平均值和標準差求得變異系數，利巴韋林、阿昔洛韋、嗎啉胍的變異系數分別為0.72%、1.47%、2.93%，變異系數均小于3%。

2.6 測定低限添加回收結果根據QC樣品測定結果計算本法的回收率，在86.25%～116.75%之間，其中荊防敗毒散中抗病毒類藥物檢測低限結果中顯示：利巴韋林、阿昔洛韋、嗎啉胍的結果平均值分別為97.35%、101.15%、99.40%；黃連敗毒散中抗病毒類藥物檢測低限結果顯示：利巴韋林、阿昔洛韋、嗎啉胍的結果平均值分別為97.30%、100.30%、99.40%。詳細結果見表5和表6。

2.7 穩定性試驗檢測結果按照方法要求，取1±0.2 g空白樣品荊防敗毒散樣品，制備成含量為40 ppb的利巴韋林、阿昔洛韋、嗎啉胍樣品，連續3 d按照本方法操作進行檢測，結果見表7。相對標準偏差分別為7.23%、10.5%、11.3%，穩定性良好。

2.8 樣品檢測結果方法建立以后隨機抽取了市售抗病毒類中成藥進行監測，共監測了36批次藥品，其中檢測到21號樣品檢測到添加了利巴韋林，33號樣品添加了阿昔洛韋和嗎啉胍，其余均為陰性。結果見表8。

3 討論

我國現階段對中成藥的非法添加監測并不是特別完善，亟需建立完善的檢測技術及監測手段。張雪嬌等[9]、田曉玲等[10]利用超高效液相色譜串聯質譜的方法對鎮靜安神藥中的非法添加化學物質進行了相應的檢測，并取得一定的效果。

表 4 荊防敗毒散中抗病毒類藥物精密度統計表Table 4 Precision statistics of antiviral drugs

表 5 荊防敗毒散中抗病毒類藥物檢測低限統計表Table 5 Table of low limit for testing of antiviral drugs

表 6 黃連敗毒散中抗病毒類藥物檢測低限統計表Table 6 Table of low limit for testing of antiviral drugs

本次試驗中主要以50 mm×2.1 μm×1.7 μm的BEHC18柱為分離柱，0.2%甲酸的水溶液及乙腈作為UPLC的流動相，甲酸在其中的作用是能夠改善色譜結果中的峰值，使樣品在質譜中的電離更加的充分，提高電離的效果。本次試驗中UPLC采用梯度洗脫程序，提高結果的分辨率及準確度，并且能夠使系統在檢測的時候具有更高的靈敏性，大大地縮短了檢測所需要的時間。流速為0.2 mL/min能將雜質峰充分分開。本次試驗UPLC通過梯度洗脫能夠在4.5 min內完成全部成分的分離過程，且分離效果良好。一般的HPLC方法進行分離的試驗平均分離時間為20 min左右，與HPLC相比本次試驗應用的方法在檢測效果較高的基礎上能夠大大地提高分離時間。

從利巴韋林、阿昔洛韋、嗎啉胍的結構和文獻報道中可以發現，利巴韋林可以生成[M+H]+（m/z245），阿昔洛韋可以生成[M+H]+（m/z226），嗎啉胍可以生成[M+H]+（m/z172）的分子離子峰，分別對其進行離子掃描，最終確認利巴韋林245＞113和245＞96為定量和定性離子對；阿昔洛韋226.06＞152.01和226.06＞135.05為定量和定性離子對；嗎啉胍171.94＞113.04和171.94＞88.01為定量和定性離子對。由于利巴韋林極性較強，在反相C18色譜柱上的保留較弱，采用高比例的水相作為梯度洗脫的初始比例，同時添加0.2%的甲酸促進正離子的電離，從而使檢測結果更加準確、可靠。本次試驗中通過對獸用中成藥中抗病毒類藥物非法添加的檢測技術的建立，可為相關產品非法添加抗病毒類藥物的監督檢驗提供技術支撐。

表 7 荊防敗毒散中抗病毒類藥物穩定性試驗結果統計表Table 7 Statistical Table for Stability Test Results of Antiviral Drugs

表 8 抗病毒類中獸藥中非法添加利巴韋林阿昔洛韋嗎啉胍的檢測陽性結果Table 8 Positive results of illegal addition of Ribavirin,acyclovir,morpholine to antiviral drugs