綿羊痘的PCR檢測與診斷

王 鋆

（河南省平頂山市葉縣畜牧局，河南 葉縣 467200）

對于困擾國內哺乳動物的天花疾病，綿羊痘是導致自然死亡率最高和臨床病理狀況最嚴重的疾病[1-3]。本病主要經呼吸道、損傷的皮膚或黏膜感染[4-6]，羊對痘病毒易感性較強，尤其是綿羊，所有綿羊無論大小羊只對痘病毒全都有易感性，羔羊免疫力低下對羊痘的抵抗力較低，羔羊感染后病死率也高，所以比成年羊易感。

羊痘根據臨床癥狀一般不難診斷，但確診還需要做實驗室檢測。必要時可取病變組織做切片，檢查感染細胞中的細胞質包涵體，或電鏡觀察病毒顆粒；或應用瓊脂擴散試驗，以抗綿羊痘高免血清檢查皮膚結節或結痂中的抗原。本研究根據數據庫中最新發表的綿羊痘病毒P32基因序列，設計并合成了1對能特異性擴增綿羊痘的特異性引物序列，通過分子診斷，建立了檢測與診斷綿羊痘的PCR方法。該方法可用來綿羊痘的診斷、檢測、預防控制與流行病學調查。

1 材料與方法

1.1 材料 病料采自河南病羊的痂皮及羊血。采取痂皮0.01 g，用液氮在無菌研缽中研磨，研磨后PBS液（pH 7.0）0.5 mL，15 000 r/min離心5 min，小心取出離心管用移液槍取上清于-80℃保存。羊血清直接保存于-80℃保存。

1.2 試劑PCR擴增試劑購自大連寶生物公司；引物由上海生工合成。DNA提取試劑盒購自上海生工。

1.3 引物的設計 根據Gen Bank中P32基因序列，設計1對特異性檢測引物。P32引物為：P32F：5'-TATGGTACCTAAATTATATACGTAAATAAC-3'；P32R：5'-TCCGAGCTCTTTCCTGATTTTTCTTACTAT-3'，預期擴增片段大小為500 bp。

1.4 DNA的提取按照上海生工動物組織快速提取試劑盒說明書，按照以下步驟進行提取：①取25～50 mg動物組織用液氮研磨成粉末或100 μL血清，加入500 μL裂解液裂解，65℃水浴1 h；②離心，保留上清液。③用移液槍加入等量的無水乙醇，用移液槍充分混勻，放置3～5 min，離心。④加入沖洗液離心，棄去上清。⑤用TE Buffer 50～100 μL溶解DNA，離心。

1.5 PCR擴增PCR反應體系為50 μL體積，反應體系中含PCR-mix 25 μL，上下游引物各2 μL，DNA 5 μL，H2O 16 μL。PCR反應程序為：95℃10 min；95℃5 min，57℃1 min，72℃1 min，35個循環；72℃延伸10 min，4℃保存。反應結束后取5 μL PCR產物電泳，凝膠于紫外投射儀中觀察結果。

1.6 特異性試驗無菌提取臨床采集的羊痘陽性痂塊和血清、羊口瘡病毒疫苗的DNA，提取DNA后作為模板DNA，用上述羊痘引物進行PCR擴增并測序。

1.7 敏感性試驗以臨床采集的陽性羊痘病料提取的DAN倍比稀釋，對其敏感性進行檢測。

1.8 臨床檢測與應用利用上述建立的檢測方法對臨床采集的病料進行檢測與鑒定。

2 結果與分析

2.1 PCR方法特異性試驗無菌提取臨床采集的羊痘陽性痂塊和血清、羊口瘡病毒疫苗的DNA，提取DNA后作為模板DNA。將羊痘病料的PCR產物測序，對該方法的特異性進行驗證。羊痘病毒擴增出500 bp的片段（圖1），產物測序和比對與羊痘同源性較高，這表明所擴增的片段為羊痘病毒，而羊口瘡病毒疫苗的DNA未擴增出條帶。

圖1 PCR特異性試驗Fig.1 PCR specificity test

2.2 敏感性試驗 以臨床采集的陽性羊痘病料提取的DAN倍比稀釋，對其敏感性進行檢測。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳，結果表明PCR方法可檢出1 pg的DNA模板，具有較高的敏感性（圖2）。

圖2 PCR敏感性試驗Fig.2 PCR sensitivity test

2.3 臨床應用 應用上述建立的方法對10份臨床疑是樣本進行檢測，結果顯示，檢出陽性樣品6份（圖3），將陽性樣品的PCR擴增產物測序后比對，均為羊痘。

3 討論

圖 3 PCR羊痘試驗Fig.3 PCR sheep pox test

羊痘發病羊只主要特征為體溫升高可達41～42℃，飲食欲降低，精神萎靡，有黏液、漿液或膿性分泌物從口、鼻中流出，在全身的各個部位，主要是會陰、鼻部、口部等部位出現結節和丘疹。致病病毒主要通過呼吸道傳染[7]，病死率也高。同時羊痘也可感染人[8-10]，因此，建立分子診斷方法是控制這種疾病的有效手段。

通常情況下，典型病例可根據臨診癥狀、病例變化和流行情況做出診斷。羊痘的確診需要進行病毒分離，分離病毒需要較長時間。同時由于病毒感染的抗體應答水平比較低[11]，瓊脂免疫擴散試驗、血凝抑制試驗由于試驗周期長或者價格昂貴等原因限制了其應用。本研究根據綿羊痘病毒P32基因序列，設計并合成了1對能特異性擴增綿羊痘的特異性引物序列，通過分子診斷，建立了檢測與診斷綿羊痘的的分子診斷方法，該方法可用來綿羊痘的診斷與流行病學調查。