口蹄疫病毒RT-LAMP檢測方法的建立

李井春

（遼寧省動物疫病預防控制中心，遼寧 沈陽 110161）

口蹄疫是一種由口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus，FMDV）引起的，主要危害偶蹄獸的急性、熱性和高度接觸性人畜共患傳染病[1]。口蹄疫病毒共有O型、A型、C型、Asial型、SAT1、SAT2和SAT3等7個血清型，而每個血清型中又包括許多的亞型，且各個血清型之間無交叉保護[2]。鑒于口蹄疫是一種嚴重的“政治經濟病”[3]，世界各國面臨的防控形勢均十分嚴峻。目前，世界上已經發現了某些泛亞毒株和A型毒株的變異，重要的是這些變異毒株已經在我國周邊國家發現[4-5]，對我國造成嚴重威脅。所以對口蹄疫病毒的快速監測、檢測變得尤為迫切，以便在疫情發生時能確實實行“早、快、嚴、小”的有效防控措施。因此迫切需要建立快速、有效的口蹄疫檢測方法，以進一步提高防控工作的準確性、時效性。在此背景下進行了口蹄疫病毒RT-LAMP診斷方法的研究。

1 材料與方法

1.1 材料 病毒RNA提取試劑購自天隆科技；RTLAMP檢測試劑盒購自北京藍譜生物 技；DEPC水及ddH2O、PBS本實驗室自配；陽性對照使用蘭州獸醫研究所液相抗體檢測試劑盒的O型、AsiaI型和A型口蹄疫病毒抗原對照，陰性對照使用DEPC水；根據下載的FMDV保守基因區域，設計合成RT-LAMP引物，序列見表1。

表1 RT-LAMP引物序列Table 1 Sequences of primers of the RT-LAMP

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取 依據天隆科技自動核酸提取說明書進行。

1.2.2 系統優化試驗 以試劑盒核心組分鏈置換酶最適反應溫度63℃為反應溫度，分別進行45 min和60 min RT-LAMP反應，確定最適反應時間；使用ddH2O稀釋內外引物，分別以內外引物比1:8和1:12進行RT-LAMP反應，確定最佳內外引物比例。

1.2.3 敏感性試驗 利用分光光度計測定核酸初始濃度，再以PBS將提取的核酸分別稀釋10-3、10-4、10-5、10-6、2-1×10-6、2-2×10-6、2-3×10-6、2-4×10-6倍進行RT-LAMP反應。

1.2.4 特異性試驗 選取A型、AsiaI、O型口蹄疫病毒抗原對照、豬瘟疫苗、藍耳病疫苗、圓環疫苗、偽狂犬疫苗和小反芻獸疫疫苗分別提取核酸后作為模板，應用所建立的方法進行特異性試驗。

1.2.5 應用試驗 應用所建立的方法對4種口蹄疫疫苗進行檢測，疫苗信息，見表2。

2 結果與分析

2.1 優化試驗 優化后確定反應體系及程序為：2×Buffer 12.5 μL，FIP（50 mm）1.2 μL，BIP（50 mm）1.2 μL，F3（10 mm）0.5 μL，B3（10 mm）0.5 μL， 酶 溶 液 1.0 μL， RNA 5 μL， DEPC 水3.1 μL，離心后的PCR管放入濁度分析儀內，或置于已調好溫度的水浴鍋內，記錄樣本擺放順序。反應條件設置：第一階段，63℃/60 min；第二階段，80℃/5 min。時間優化、引物優化結果分別見圖1和圖2。

表2 試驗所用疫苗Table 2 Vaccines used in the RT-LAMP

2.2 敏感性試驗FMDV初始濃度經測定為20.082 μg/L，試驗可檢出的最低濃度為在此濃度基礎上稀釋2-3×10-6倍，2-4×10-6稀釋度無擴增曲線，見圖3。

圖3 敏感性試驗Fig.3 Sensitivity test of the RT-LAMP

圖1 反應時間優化Fig.1 Time optimization of the RT-LAMP

圖2 內、外引物優化Fig.2 Inner/outer primers Optimization of the RT-LAMP

2.3 特異性試驗只有3種亞型口蹄疫病毒抗原對照有擴增曲線，其他樣品均未擴增出任何曲線，見圖4。

圖4 特異性試驗Fig.4 Specificity test of the RT-LAMP

2.4 應用試驗4種口蹄疫疫苗樣品均有明顯的擴增曲線，見圖5。

圖5 應用試驗結果Fig.5 Detection results of Clinical samples by the RT-LAMP

3 討論

口蹄疫的有效控制關鍵在于早期檢測,準確的檢測是防制口蹄疫的重要環節。近年來，FMDV的檢測技術發展迅速，建立血清學和分子生物學在內的多種檢測方法。吳曉衛等[6]建立了實時熒光RT－qPCR方法，楊洋等[7]建立了real-timeRT-RPA方法。這些方法具有特異性強等特點，但或存在耗時長，或需要昂貴的儀器進行反應；且以上方法的終點檢測均需要一定的設備支持。目前，對于FMDV的檢測金標準為病毒分離與鑒定[8]，但此方法同樣費時、費力、技術水準要求高，一般實驗室不能進行。RTLAMP檢測技術是近年發展起來的新型技術，可實現在恒溫條件下方便、快速、靈敏、特異的檢測，已在多種主要動物病原體檢測上得到應用[9-10]。蘭德松等[11]建立了豬瘟病毒通用型RT-LAMP檢測方法，與豬瘟熒光RT-PCR方法相比敏感性高10倍；楊卓等[12]建立了利用濁度分析儀檢測小反芻獸疫RT-LAMP的方法，可實時觀察反應的進行。RT-LAMP技術可通過反應終產物是否形成白色沉淀可判斷擴增有否進行，如在反應體系內加入目視試劑，則終產物在紫外燈照射下發出明顯的綠色熒光就可判斷有擴增反應發生，終點檢測非常易于判斷。如將RT-LAMP方法的各組分標準化組裝后，易于在一般實驗室推廣使用，而且也利于開展現場診斷。本研究針對FMDV保守區域設計合成6條特異性引物，成功建立了FMDV RT-LAMP檢測方法，為口蹄疫的快速檢測奠定了基礎。