大蒜素對小腸缺血再灌注損傷保護作用的研究

武向鵬，崔 薇

0 引言

小腸缺血再灌注損傷是外科腸道手術及休克、心肺功能不全等常見并發癥，其病理機制復雜，既往研究發現,氧化應激損傷、炎癥反應及繼發性細胞凋亡是小腸缺血再灌注損傷發生發展的重要病理機制[1-4]。大蒜素是一種天然存在的二烯丙基三硫化物，具有抗氧化、抗炎、抗凋亡等生物學活性[5-7]。以往動物研究已經證實，大蒜素能夠通過抑制氧化應激、炎癥反應、細胞凋亡等對腦組織、腎臟、心肌、肝臟等組織器官的缺血再灌注損傷起到一定的保護作用，但大蒜素對小腸缺血再灌注損傷是否具有保護作用尚未見文獻報道，本實驗將對這一問題進行實驗研究，并探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級雄性SD大鼠(8周齡，210～250 g)購自河北省實驗動物中心[SCXK(冀)2008-1-003]。飼養環境：恒溫23～25 ℃、相對濕度65%～70%、光照周期12 h∶12 h。

1.2 實驗藥物與試劑 大蒜素注射液(上海禾豐制藥有限公司，2 ml∶30 mg，批號：950041)；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素(IL)-1β、IL-6、內毒素酶聯免疫檢測試劑盒(北京博奧森生物工程有限公司，批號：170416、170125、170409、070411)；超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)試劑盒和TUNEL試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：20170403、20170512、20170324、20170321)。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組與模型制備 將100只試驗用SD大鼠按照隨機數字表法隨機分為假手術組，模型組，大蒜素5、10、20 mg/(kg·d)組，每組20只；各組大鼠均在造模前5 d開始腹腔注射給藥(1次/d)，假手術組、模型組大鼠同步給予生理鹽水。術前禁食12 h(自由飲水)后，參照朱枝祥等[8]報道的實驗方法制備小腸缺血再灌注大鼠模型：腹腔注射水合氯醛(2%，5 ml/kg)實施麻醉，開腹并剝離腸系膜上動脈，夾閉60 min后松夾實現再灌注，小腸缺血再灌注模型造模結果的判定：夾閉腸系膜上動脈后腸管顏色變暗而松夾后顏色逐漸變紅，即可判定造模成功；假手術組行手術操作但不夾閉腸系膜上動脈。

1.3.2 小腸組織含水量測定 每組隨機取5只大鼠，實施麻醉后開腹，取回盲部10 cm以上處相同部位4 cm腸管組織，沖洗干凈后稱重(W1)，置107 ℃烘烤72 h后再次稱重(W2)，含水量=[(W1-W2)/W1]×100%。

1.3.3 小腸組織病變及Chiu′s氏評分 每組隨機取5只大鼠，參照“1.3.2”項方法取腸管組織并沖洗干凈后，置4%多聚甲醛溶液中固定72 h，然后依次進行包埋、切片、脫蠟水化等處理后行HE染色，然后通過倒置光學顯微鏡觀察小腸組織病理學改變。參照Chiu等[9]報道的組織損傷評分量表進行小腸組織損傷評分，見表1。

表1 小腸組織損傷Chiu′s氏評分量表

1.3.4 細胞凋亡狀況觀察及凋亡指數計算 取“1.3.3”項制備的石蠟組織切片，脫蠟水化后，遵照TUNEL試劑盒方法步驟處理，黃褐色著色為陽性細胞(凋亡細胞)，通過倒置顯微鏡觀察。凋亡指數=(陽性細胞數/總細胞數)×100%，分別計數5個互不重疊的視野，取平均值。

1.3.5 小腸組織炎癥細胞因子、內毒素、抗氧化酶、MDA測定 取每組剩余的10只大鼠，參照“1.3.2”項方法取腸管組織并用冷生理鹽水沖洗干凈后，研磨勻漿，3 000 r/min離心10 min后取上清液，嚴格按照各試劑盒操作方法步驟，通過酶標儀測定小腸組織炎癥細胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)和內毒素表達水平；通過紫外分光光度計測定抗氧化酶(SOD、CAT)活性和MDA含量。

2 結果

2.1 各組大鼠小腸組織含水量比較 與假手術組比較，模型組大鼠小腸組織含水量升高(P<0.01)；與模型組比較，大蒜素10、20 mg/(kg·d)組含水量降低(P<0.05或P<0.01)。見表2。

表2 各組大鼠小腸組織含水量比較(n=5)

注：與模型組比較，*P<0.05,**P<0.01

2.2 各組大鼠小腸組織病變及Chiu′s氏評分比較 假手術組小腸組織腸絨毛完整、排列整齊，未見異常；模型組小腸組織可見上皮細胞脫落、絨毛尖端上皮抬高與固有層分離、中性粒細胞浸潤等明顯的病理學改變；與模型組比較，大蒜素組小腸組織病變明顯減輕，其中大蒜素20 mg/(kg·d)組效果最為顯著。見圖1。與假手術組比較，模型組大鼠小腸組織Chiu′s氏評分升高(P<0.01)；與模型組比較，大蒜素10、20 mg/(kg·d)組Chiu′s氏評分降低(P<0.05或P<0.01)。見表3。

2.3 各組大鼠小腸組織細胞凋亡及凋亡指數比較 假手術組未見凋亡細胞，與假手術組比較，模型組小腸組織凋亡細胞數量明顯增多、凋亡指數明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，大蒜素10、20 mg/(kg·d)組凋亡細胞數量明顯減少、凋亡指數明顯降低(P<0.05或P<0.01)。見圖2、表3。

2.4 各組大鼠小腸組織炎癥細胞因子和內毒素含量比較 與假手術組比較，模型組大鼠小腸組織中炎癥細胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)和內毒素水平明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，大蒜素10、20 mg/(kg·d)組TNF-α、IL-1β、IL-6、內毒素含量明顯下降(P<0.05或P<0.01)。見表4。

表3 各組大鼠小腸組織細胞凋亡指數比較(n=5)

注：與模型組比較，*P<0.05,**P<0.01

2.5 各組大鼠小腸組織抗氧化酶活性及MDA含量比較 由表5可知，與假手術組比較，模型組大鼠小腸組織抗氧化酶(SOD、CAT)活性降低，而MDA含量升高(P<0.01)；與模型組比較，大蒜素10、20 mg/(kg·d)組SOD、CAT活性升高，而MDA含量降低(P<0.05或P<0.01)。

圖1 各組大鼠小腸組織病變(HE，400×)

圖2 各組大鼠小腸組織細胞凋亡狀況(TUNEL，400×)

組別TNF-α(ng/g)IL-1β(ng/g)IL-6(ng/g)內毒素(kEu/g)假手術組9.13±1.27??45.94±5.18??59.25±7.95??0.13±0.03??模型組48.76±8.1090.12±9.65214.36±38.090.97±0.19大蒜素5 mg/(kg·d)組43.22±7.4683.71±10.96185.37±39.120.83±0.22大蒜素10 mg/(kg·d)組32.98±6.23??77.30±9.24?159.68±35.43?0.74±0.20?大蒜素20 mg/(kg·d)組19.14±4.08??69.83±8.15??113.52±30.06??0.62±0.16??

注：與模型組比較，*P<0.05,**P<0.01

表5 各組大鼠小腸組織抗氧化酶活性及MDA含量比較(n=10)

注：與模型組比較，*P<0.05,**P<0.01

3 討論

病理生理學研究發現，氧化應激、炎癥反應及繼發性細胞凋亡是小腸缺血再灌注損傷發生發展的重要病理機制[1-4]，而大蒜素具有抗氧化、抗炎、抗凋亡的藥理學作用[5-7]。本研究發現，經大蒜素10、20 mg/(kg·d)預處理5 d，能夠有效降低小腸缺血再灌注大鼠小腸組織含水量，改善小腸組織病變，降低Chiu′s氏評分，抑制小腸組織細胞凋亡，提示大蒜素對大鼠小腸缺血再灌注損傷具有一定的保護作用。

炎癥細胞因子水平是監測體內炎癥反應的常用指標；而內毒素是一種具有毒性作用的脂多糖，能夠導致機體發熱、微循環障礙、內毒素休克等。本研究發現，經大蒜素10、20 mg/(kg·d)預處理5 d，能夠有效降低小腸缺血再灌注大鼠小腸組織中TNF-α、IL-1β、IL-6和內毒素含量，提示大蒜素對大鼠小腸缺血再灌注后出現的炎癥反應具有一定的抑制作用。

組織缺血再灌注后氧自由基(ROS)過剩是氧化應激損傷發生的病理基礎，生理狀態下ROS能夠在抗氧化酶(SOD、CAT)相繼催化作用下最終被還原生成H2O和O2[10]；但過剩的ROS將攻擊細胞膜，使其主要成分不飽和脂肪酸被氧化破壞，其中MDA為氧化應激損傷終產物之一，因此，SOD、CAT活性和MDA含量水平能直接和間接反映機體氧化應激損傷程度[11]。本實驗研究發現，大蒜素10、20 mg/(kg·d)預處理5 d，能夠有效提高大鼠小腸缺血再灌注后小腸組織SOD、CAT活性并降低MDA含量，提示大蒜素對大鼠小腸缺血再灌注后氧化應激損傷具有一定的抑制作用。

綜上所述，大蒜素對大鼠小腸缺血再灌注損傷具有一定的保護作用，其作用機制可能與大蒜素抑制小腸組織細胞凋亡、氧化應激反應及炎癥反應有關。