利用生物信息學數(shù)據(jù)庫篩選藥物藥動學、藥效學相關基因及其多態(tài)性位點

張 遠，何 霞，串俊蘭，鐘 磊，喻冬柯，熊 萱

0 引言

藥物基因組學是建立在“基因多態(tài)性是形成個體差異的重要原因”這一理論基礎之上，主要研究遺傳變異如何影響個人對藥物反應，并根據(jù)遺傳變異特點選擇治療指數(shù)高、毒副作用小的藥物，保障藥物治療的安全性和有效性，是列入“十三五”國家科技創(chuàng)新規(guī)劃“精準醫(yī)療”的重要部分之一。但藥物的有效性和安全性并非單一基因和多態(tài)性位點可以決定的，針對基因-基因、基因-環(huán)境交互作用的研究是藥物基因組學未來的方向。然而，如何選取藥物相關應答的基因及多態(tài)性位點是臨床研究中大多數(shù)研究者面臨的一個難題。雖然全基因組或外顯子測序可以涵蓋更全面的基因和多態(tài)性位點，但花費較高，難以應用于臨床；從文獻中篩選位點猶如大海撈針，難以選擇到證據(jù)級別較高，與臨床藥物應答相關性較大的潛在的基因和位點。生物信息學的誕生為解決這類問題提供了幫助。生物信息學專門從事對基因組研究相關生物信息的獲取、加工、儲存、分配、分析和解釋。如果能從數(shù)據(jù)庫中方便、快速地檢索到證據(jù)級別較高、臨床相關性較大的藥物相關基因和位點，不但可以節(jié)約時間、經(jīng)費，還能一定程度上降低數(shù)據(jù)維度，為研究者進行基因-基因、基因-環(huán)境的研究設計階段和后期數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理提供一定的便利。

重度抑郁癥(MDD)，也被稱為抑郁障礙，保守估計我國大約有7 000萬人受其影響。作為一種高致殘性疾病，抑郁障礙已經(jīng)成為我國一個重大的公共衛(wèi)生問題[1]。抗抑郁藥物雖然可以有效治療MDD，但個體間差異也較大：約30%～40%的患者沒有得到完全緩解[2]。西酞普蘭及其S-對映體艾司西酞普蘭屬于選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑(SSRIs)，是MDD一線治療用藥。然而，早有證據(jù)顯示，遺傳差異對(艾司)西酞普蘭的反應有一定影響。美國FDA已將CYP2D6(細胞色素P450家族2D6)和CYP2C19(細胞色素P450家族2C19)的遺傳效應寫入了藥品說明書。同時，有報道，SLC6A4(溶質(zhì)載體家族6成員4) rs4795541、BDNF(腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子)Val66Met、HTR2A(5-羥色胺2A受體)rs6311、TPH2(色氨酸羥化酶2)rs1800532等與西酞普蘭的藥效學或藥動學相關[3-5]。但與其他疾病不同的是，抑郁障礙的緩解受環(huán)境因素影響也很大：如年齡、性別、婚姻狀況、教育程度、是否進行了心理治療、居住地、職業(yè)和收入等[6-7]。因此，對于抗抑郁藥物個體化差異的研究僅關注遺傳差異性是遠遠不夠的。本研究以抗抑郁藥物西酞普蘭為例，介紹幾種常用的生物信息學數(shù)據(jù)庫的搜索方式，為基因及多態(tài)性位點的篩選模式提供參考。

1 材料與方法

1.1 生物信息學數(shù)據(jù)庫搜索篩選與(艾司)西酞普蘭相關基因 本研究所選取的生物信息學數(shù)據(jù)庫均為公共免費數(shù)據(jù)庫。GenCards數(shù)據(jù)庫是由以色列魏茨曼科學研究所(Weizmann Institute of Science)和Crown人類基因組中心(Crown Human Genome Center)整合各方資源所建立，包含了非常全面的關于基因及其產(chǎn)物的生物醫(yī)學信息。它界面友好，使用戶能方便地找到感興趣的研究內(nèi)容。UniProt是由歐洲生物信息學研究所(European Bioinformatics Institute)、美國蛋白質(zhì)信息資源(Prontein Information Resource)以及瑞士生物信息研究所(Swiss Institute of Bioinformatics)等機構共同組成的UniProt協(xié)會(UniProt Consortium)編輯、制作的一個信息資源，旨在提供一個有關蛋白質(zhì)序列及其相關功能方面的廣泛的、高質(zhì)量的并可免費使用的共享數(shù)據(jù)庫。PharmGKB是由美國國立衛(wèi)生院創(chuàng)建，收集了史上最完整的與藥物基因組相關的基因型和表型信息，該數(shù)據(jù)庫的特點是提供了高證據(jù)級別的基于基因型藥物劑量指南推薦。以上3個數(shù)據(jù)庫可以直接使用藥名搜索，本研究檢索詞為 “citalopram OR escitalopram”(“西酞普蘭OR艾司西酞普蘭”)。

1.2 ClinVar篩選所選基因多態(tài)性位點 ClinVar也是一個公共免費數(shù)據(jù)庫，由NCBI(美國國立生物技術信息中心)建立。收集了大量的基因突變與疾病或藥物的關聯(lián)信息，還對信息的級別進行了測評和注解。將以上3個數(shù)據(jù)庫所搜索得到的基因名稱輸入ClinVar，并通過注解篩選多態(tài)性位點。

1.3 利用文獻數(shù)據(jù)庫篩選基因 為對比生物信息學數(shù)據(jù)庫搜索得到的基因和文獻數(shù)據(jù)庫搜索得到的基因結(jié)果一致性，本研究以“(citalopram OR escitalopram)AND gene polymorphism”為檢索詞，搜索PubMed和中國生物醫(yī)學文獻數(shù)據(jù)庫(CBM)，時間到2017年12月31日截止。研究內(nèi)容為探討(艾司)西酞普蘭和基因多態(tài)性的相關性臨床試驗。搜集文獻的名稱、年限、第一作者及所研究的基因。以基因研究文獻的篇數(shù)界定該基因是否為(艾司)西酞普蘭的臨床相關性較大的基因，即熱點基因。

2 結(jié)果

2.1 基因篩選結(jié)果 將檢索詞輸入GeneCards，共得到140條結(jié)果(相關性得分1.1～21.2)，從UniProtKB得到13條結(jié)果，從PharmGKB得到26條結(jié)果(證據(jù)級別1A級～4級)(表1)。本研究選取GeneCards的前20條結(jié)果(相關性得分在5.63以上)和PharmGKB的前20條結(jié)果(證據(jù)級別均在3級以上)。3個生物信息學數(shù)據(jù)庫中有4個共同基因被確定：分別是SLC6A4、CYP2C19、CYP2D6和ABCB1(多藥耐藥基因1)(圖1)。

表1 GeneCards、PharmGKB、UniprotKB數(shù)據(jù)庫搜索(艾司)西酞普蘭相關基因

注：*前20條結(jié)果目

圖1 GeneCards、PharmGKB、UniprotKB數(shù)據(jù)庫搜索(艾司)西酞普蘭相關基因重疊數(shù)文氏圖

注：A：GeneCards；B：PharmGKB；C：UniprotKB

2.2 多態(tài)性位點篩選結(jié)果 將上述4個基因名稱分別輸入ClinVar數(shù)據(jù)庫中，根據(jù)“條件”(Conditions)和“臨床意義”(Clinical Significants)的描述選擇與藥物藥動學、藥效學相關的位點。其中，SLC6A4基因選取的是rs1131692236；CYP2C19是rs12248560，rs28399504、rs4986893，rs4244285，rs56337013；CYP2D6是rs730882251，rs267608319，rs730882170，rs16947，rs35742686，rs3892097，rs5030865，rs5030655，rs373000587，rs267608275，rs1065852；ABCB1是rs2032582 rs1045642(表2)。

表2 ClinVar數(shù)據(jù)庫搜索基因多態(tài)性位點

2.3 文獻篩選結(jié)果 將檢索詞輸入文獻數(shù)據(jù)庫PubMed和CBM中，一共得到173篇文獻，其中PubMed 159篇，CBM 14篇。查閱題目和摘要后剔除動物實驗、綜述、表觀遺傳學研究、全基因組關聯(lián)分析及重復研究之后一共有38篇文獻符合要求。其中研究基因頻率從高到低排列是SLC6A4(13/38)、CYP2C19(12/38)、CYP2D6(6/38)、TPH1(5/38)、HTR2A(4/38)、BDNF(3/28)、ABCB1(2/38)、TPH2(2/38)、CYP3A4(2/38)、MAOA(2/38)、HTR6(1/38)、HTR5A(1/38)、HTR2C(1/38)、HTR1A(1/38)、CYP3A5(1/38)、CRHBP(1/38)、CNR1(1/38)、ABCC1(1/38)、5-HT1A(1/38)。見圖2。

圖2PubMed和CBM文獻搜索(艾司)西酞普蘭相關基因研究頻率從高到低柱狀圖

注：A：GeneCards；B：PharmGKB；C：UniprotKB

3 討論

隨著人類基因組測序的完成，基因組學已進入“后基因時代”，也稱“功能基因組時代”，即從揭示生命所有遺傳信息到了分子水平的功能研究之上，由此誕生了一系列以研究功能為目的的“組學”科學，如“藥物基因組學”、“環(huán)境基因組學”等。目前全球已有很多研究機構通過深度測序獲得了有關疾病或藥物反應的基因編碼，但大多數(shù)全基因組關聯(lián)分析(GWAS)雖耗費了大量的人力物力，卻并未找到關鍵基因多態(tài)性位點，或者結(jié)果報道不一致[8-9]。對于臨床一線的科研人員來說，重復GWAS研究或者從海量文獻中篩選目標基因多態(tài)性位點做臨床表型的關聯(lián)分析會消耗大量的時間和經(jīng)費，幾乎難以完成。于是，了解和掌握生物信息學數(shù)據(jù)庫的使用是一個可以讓研究過程事半功倍的方法。

與文獻搜索對比結(jié)果顯示，GeneCards、PharmGKB和UniprotKB共有的4個基因中有三個(SLC6A4、CYP2C19、CYP2D6)是排列在文獻搜索結(jié)果的前3位，但ABCB1沒有在文獻搜索的結(jié)果前4項中，而是在TPH1(色氨酸羥化酶1)、HTR2A(5-羥色胺受體2A)和BDNF之后。TPH1、HTR2A和BDNF雖然都在GeneCards中出現(xiàn)，但相關性得分分別為13.59、26.2、9.53，排名分別是11、1、17，TPH1、HTR2A和BDNF中任何一個都沒在UniprotKB中出現(xiàn)而PharmGKB中只有TPH1(證據(jù)級別為3級)。由此看來，與搜索文獻數(shù)據(jù)庫相比，GeneCards數(shù)據(jù)庫較為全面和準確，只是如果按相關性高低來篩選基因，可能會遺漏潛在相關性較大的基因，如果全部檢測，則可能造成時間和經(jīng)費的浪費。當然，僅靠文獻數(shù)量來確定該基因是否與臨床相關性較大是有一定片面性：雖然研究該基因的研究者多，但研究質(zhì)量可能不高，如研究樣本較少、未采用金標準檢測方法等，而研究數(shù)量少的可能反而質(zhì)量較高。或者，研究藥效學的基因(如靶蛋白等，與緩解率有關[4-5,10-11])本身就比研究藥動學的基因(如各種代謝酶或轉(zhuǎn)運體，與不良反應有關[12-17])吸引更多的臨床關注。此外，采用本研究的方式篩選到基因和位點后，還需要搜索該位點在特定人種中的突變頻率，如果突變位點頻率太低，則將其納入臨床研究中檢測的意義并不大。以這次的結(jié)果為例，在中國漢族人群中，CYP2C19*17、*4、*3的突變頻率均在10%以下，而*5沒有數(shù)據(jù)報道；對于CYP2D6，只有rs16947和*10有較高的(>10%)突變頻率，其余位點頻率均較低或沒有報道。突變頻率的信息可以在NCBI的dbSNP數(shù)據(jù)庫中查到。

綜上所述，采用生物信息學數(shù)據(jù)庫搜索基因+ClinVar搜索多態(tài)性位點的檢索模式可以節(jié)約大量時間和精力，從文獻中查找基因和位點，為后續(xù)試驗設計和統(tǒng)計帶來方便，值得向?qū)蚨鄳B(tài)性感興趣的臨床一線工作人員推薦。