姜黃素聯合阿霉素對肝癌PLC/PRF/5細胞增殖凋亡及化療藥物增敏的作用及機制研究

劉學飛，張俊梅，徐 龍

0 引言

肝癌是世界范圍內的一類常見惡性腫瘤，其在發展中國家發病率極高[1]，在我國，肝癌在所有惡性腫瘤的發病率中位居第二[2]。目前，臨床上治療肝癌的首選方案以肝臟切除手術和化療相結合的方式為主[3]，但因為肝癌細胞對化療藥物敏感性差，因此預后效果不佳[4]。阿霉素是臨床上常用的一類廣譜抗腫瘤藥物，治療肝癌有一定效果，但同時有很強的毒副作用和耐藥性[5]，因而影響了治療效果。姜黃素是提取自姜黃根莖的一種多酚，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等藥理作用[6]。有研究表明，姜黃素可通過對化療藥的增敏作用，聯合抑制人前列腺癌、喉癌等多種腫瘤細胞，且安全性較高[7-8]。本次實驗通過比較姜黃素和阿霉素聯用與單用阿霉素對人肝癌PLC/PRF/5細胞增殖、凋亡和化療敏感性的作用效果，為臨床治療肝癌篩選更合理、更有效的化療藥物治療方案提供理論支持。

1 實驗材料

1.1 細胞和動物 人肝癌PLC/PRF/5細胞株(中國科學院上海細胞所)；裸鼠，雄性，4～6周齡，體重15～20 g(濟南朋悅實驗動物繁殖有限公司)。

1.2 試劑 姜黃素：南京道斯夫生物科技有限公司；鹽酸阿霉素：浙江海正藥業股份有限公司；胎牛血清、含雙抗的DMEM、胰蛋白酶：武漢普諾賽生命科技有限公司；PBS緩沖液、MTT溶液：上海奧陸生物科技有限公司；TUNEL熒光一抗：武漢博士德生物工程技術有限公司；RT-PCR逆轉錄試劑盒、Trizol、Marker：北京TRANSGEN生物技術有限公司。

1.3 實驗儀器 恒溫培養箱；Olympus BX5顯微鏡；低溫離心機；高壓蒸汽滅菌鍋；-80 ℃超低溫冰箱；電子天平儀。

2 實驗方法

2.1 體外實驗

2.1.1 細胞培養與實驗分組 將人肝癌PLC/PRF/5細胞接種于含10%滅活的胎牛血清和雙抗的DMEM培養基中，置于37 ℃、5% CO2的恒溫細胞培養箱中培養，待細胞長滿至培養皿約90%時，用0.25%胰蛋白酶進行消化制成單細胞懸液，進行下一步傳代。根據不同的干預藥物將細胞分為3組，分別為對照組、阿霉素組(2 μmol)、姜黃素(10 μmol)聯合阿霉素(2 μmol)組(聯合組)。

2.1.2 MTT法檢測各實驗組藥物對人肝癌PLC/PRF/5細胞生存抑制情況 ①細胞接種：將單細胞懸液接種于96孔板中，每孔內含細胞數量5×103個/180 μl，將96孔板置于37 ℃、5% CO2的恒溫細胞培養箱中培養12 h，待細胞貼壁后，按實驗分組向培養孔中加入相應藥物。將鹽酸阿霉素和姜黃素分別溶解在DMEM培養液中，并分別稀釋至濃度為0.054 mg/ml和0.018 mg/ml，對照組培養孔中加10 μl空白的DMEM培養液，阿霉素組培養孔中加入10 μl溶有鹽酸阿霉素的DMEM培養液，聯合組培養孔中加入10 μl阿霉素溶液和10 μl姜黃素溶液，另外增設只含培養基組，作為空白孔。每組設置6個平行實驗孔。將其置于37 ℃、5% CO2的恒溫細胞培養箱中培養48 h。②MTT法檢測細胞抑制情況：將培養48 h后的96孔板取出，每孔加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl，孵育4 h后棄去上清液，每孔加入DMSO 150 μl，微孔振蕩器震蕩10 min，490 nm波長條件下用紫外-熒光酶標儀測定各培養孔的吸光度值(OD值)，重復測量3次，根據公式計算人肝癌PLC/PRF/5細胞在不同藥物作用下的抑制率，存活率(%)=(1-待測孔OD值/對照孔OD值)×100%。

2.1.3 RT-PCR方法檢測人肝癌PLC/PRF/5細胞內Caspase-3基因表達 Trizol提取總RNA，行逆轉錄反應。取2 μl進行PCR擴增，內參為GAPDH，內參引物序列：Sense，GTATAATGAGAAGCCAGACCAT；Antisene，ACAGCTTCTCAAGTCT。Caspase-3 mRNA的引物序列：Sense，GTTATCCCTGCTTCACTACT；Antisense，GAGACACTCTGTCCACACC。Caspase-3 mRNA及內參擴增條件：94 ℃預變性2 min，1個循環；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35個循環；72 ℃總延伸6 min。取5 μl PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，紫外線投射儀下觀察電泳條帶，分析目的基因Caspase-3 mRNA和參比基因的條帶灰度值。

2.2 體內實驗

2.2.1 動物模型建立 本實驗一共15只裸鼠，在SPF級環境下飼養。取對數期人肝癌PLC/PRF/5細胞，用0.25%胰蛋白酶進行消化，制成1×108/ml單細胞懸液，每只裸鼠注射2 ml于肩背部皮下，接種后第14天左右，裸鼠背部出現直徑為5 mm左右的腫瘤結節，當腫瘤組織體積至少61 mm3時，證明裸鼠人肝癌PLC/PRF/5細胞移植瘤模型建立。腫瘤體積的測量方法是，用游標卡尺分別測量腫瘤的長徑和短徑，按公式計算腫瘤體積，體積(cm2)=(長徑×短徑2)/2。

2.2.2 動物分組及給藥 將實驗動物隨機分為空白對照組(對照組)、阿霉素治療組(阿霉素組)、姜黃素聯合阿霉素治療組(聯合組)，每組5只。建模成功(即第14天起)開始給藥，每天1次，持續給藥10 d。其中阿霉素組裸鼠給予腹腔注射阿霉素溶液1 mg/(kg·只)，聯合組裸鼠給予腹腔注射阿霉素溶液1 mg/(kg·只)+姜黃素溶液10 mg/(kg·只)，對照組給予等量生理鹽水。每天稱量體重，測量腫瘤組織體積，觀察實驗動物飲食及精神狀態的變化，并加以記錄。

2.2.3 測量腫瘤體積和重量 在開始給藥前(第14天)，量取裸鼠皮下腫瘤組織的長徑和短徑，并計算體積，經過10 d的治療后，將裸鼠處死，取出皮下的腫瘤組織，同時計算此時腫瘤組織的體積，并稱取重量。

2.2.4 實驗動物的處死及標本提取 在腫瘤移植后第24天，將所有實驗裸鼠脫頸椎處死。將腫瘤組織剝離，稱量重量，測量體積后，將每個腫瘤分成兩部分，其中一部分固定于10%甲醛溶液中，24 h后用石蠟包埋制成蠟塊，另一部分保存于-80 ℃冰箱。

2.2.5 TUNEL染色檢測腫瘤組織中細胞凋亡情況 參照文獻中實驗步驟[8]，用TUNEL免疫熒光試劑漂染腫瘤石蠟標本切片，用Olympus FV1000激光共聚焦顯微鏡拍照，每個腫瘤組織隨機選取3張切片，每張切片在熒光顯微鏡下隨機選取5個視野，觀察TUNEL陽性細胞數量在總細胞數量中所占比例。

3 結果

3.1 MTT法檢測不同治療藥物對人肝癌PLC/PRF/5細胞增殖的影響 阿霉素組細胞抑制率為27.68%，顯著高于空白對照組的3.96%(P<0.05)；聯合組細胞抑制率為39.83%，顯著高于阿霉素組(P<0.05)。三組間比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

3.2 TUNEL免疫熒光法檢測腫瘤組織中凋亡細胞數量 由圖1可見，阿霉素組TUNEL陽性細胞染色數量多于對照組，而聯合組腫瘤細胞的熒光染色數量最多。在顯微鏡鏡下相同的視野范圍內，對照組凋亡的腫瘤細胞數量為(202.64±11.72)個，阿霉素組凋亡的腫瘤細胞數量為(289.75±25.37)個，多于對照組(P<0.05)，聯合組凋亡的腫瘤細胞數量為(426.93±31.58)個，顯著多于對照組和阿霉素組(P<0.05)。

3.3 RT-PCR檢測腫瘤細胞內Caspase-3基因表達情況 對照組條帶相對灰度值為0.132±0.005，阿霉素組條帶相對灰度值(0.386±0.025)高于對照組(P<0.01)，聯合組條帶灰度值(0.588±0.054)高于阿霉素組(P<0.01)。見圖2。

圖1 體內實驗各組腫瘤組織內TUNEL陽性細胞數量比較

圖2 體外實驗各組細胞Caspase-3 mRNA表達情況比較

3.4 三組動物腫瘤體積比較 治療前，三組動物腫瘤體積比較差異無統計學意義(F=45.82，P>0.05)；各組治療后體積及治療前后體積差之間差異有統計學意義(F=67.96，P<0.01；F=63.39，P<0.01)。治療前，阿霉素組腫瘤體積與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)；治療10 d后，阿霉素組腫瘤體積小于對照組(P<0.01)，治療前后體積差小于對照組(P<0.01)。治療前，聯合組腫瘤體積與對照組、阿霉素組比較差異無統計學意義(P>0.05)；治療后，聯合組腫瘤體積和治療前后體積差均小于阿霉素組(P<0.01)。見表2。

表2 治療前后裸鼠皮下腫瘤體積比較(mm3)

注：與阿霉素組比較，**P<0.01

3.5 三組腫瘤重量比較 三組腫瘤重量比較差異有統計學意義(F=52.47,P<0.05)。阿霉素組腫瘤組織重量小于對照組(P<0.05)；聯合組腫瘤組織重量小于阿霉素組(P<0.05)。見表3。

表3 不同治療手段對裸鼠皮下腫瘤重量的影響

注：與阿霉素組比較，**P<0.01

4 討論

肝癌是發病率、死亡率都很高的一類惡性腫瘤，極大地威脅著人類健康[1-2]。目前，臨床首選的治療方案是手術聯合化療，但肝癌細胞對常規的化療藥物有很強的耐受性，敏感性差，因此，治療效果往往不理想，不能改善患者的治療結局[3-4]。阿霉素是臨床上一種重要的化療藥物，通過誘導腫瘤細胞的DNA損傷而誘發其凋亡，能有效抑制多種癌細胞[5]，因為其毒副作用明顯，臨床上往往與其他藥物聯合使用，以降低對患者的損傷[9]，但肝癌患者對該藥的敏感性較差[5]。姜黃素是一種從植物姜黃中提取的多酚，有研究報道，姜黃素可通過對化療藥的增敏作用聯合抑制人前列腺癌、喉癌等多種腫瘤細胞，且安全性較高[7-8，10-13]，但其對人肝癌細胞的作用尚未見報道。

癌癥之所以難以治愈，其重要原因之一是癌細胞能夠在機體內無限增殖[14]，因此，抑制癌細胞增殖是治療癌癥的關鍵[15]。本研究通過MTT法，檢測不同干預藥物對人肝癌PLC/PRF/5細胞增殖的影響，結果顯示，阿霉素干預組的細胞抑制率為27.68%，顯著高于對照組，說明阿霉素能抑制人肝癌PLC/PRF/5細胞的存活和增殖，聯合組細胞抑制率為39.83%，明顯高于阿霉素干預組，說明姜黃素和阿霉素聯用后，增強了對人肝癌PLC/PRF/5細胞增殖的抑制作用。

阿霉素抑制癌細胞的主要作用機制是誘導腫瘤細胞的凋亡，前期研究表明，姜黃素對HepG2細胞的凋亡有促進作用[16]，但對于人肝癌PLC/PRF/5細胞的作用鮮有報道。本研究將姜黃素和阿霉素聯合作用于人肝癌PLC/PRF/5細胞，檢測其對人肝癌PLC/PRF/5細胞凋亡的影響，并與單獨使用阿霉素的凋亡反應相比較，結果顯示，在顯微鏡鏡頭下相同的視野范圍內，阿霉素組凋亡腫瘤細胞的數量顯著多于對照組，證明阿霉素能促進人肝癌PLC/PRF/5細胞的凋亡，而聯合組凋亡的腫瘤細胞數量多于阿霉素組，說明兩藥聯用之后促凋亡作用增強，表明姜黃素增加了阿霉素對人肝癌PLC/PRF/5細胞的凋亡作用。

Caspase家族是凋亡信號轉導過程中重要的凋亡蛋白酶，而Caspase-3處于各凋亡途徑的樞紐環節，是最重要的凋亡調控因子[17]，因此，Caspase-3的表達能側面反映細胞的凋亡程度。本研究的體外實驗中檢測了不同藥物干預后人肝癌PLC/PRF/5細胞Caspase-3的基因表達，結果顯示，聯合組的Caspase-3基因表達最強烈，顯著高于阿霉素組和對照組，阿霉素組Caspase-3基因表達顯著高于對照組。因此，進一步證實了姜黃素與阿霉素聯用對人肝癌PLC/PRF/5細胞凋亡的促進作用要強于阿霉素。

肝癌之所以預后性差，主要原因是肝癌細胞對化療藥物存在高度的耐受性[3-4]，因此，提高肝癌細胞對化療藥物的敏感性是治療肝癌的重要切入點。本研究中，我們通過比較不同藥物治療后小鼠體內腫瘤體積的變化，評估肝癌細胞對不同化療藥敏感性的差異，結果發現，三組治療后腫瘤體積以及治療前后體積差之間差異均有統計學意義，治療后三組腫瘤的重量差異也有統計學意義，且姜黃素與阿霉素聯合組腫瘤的體積和重量均小于對照組和阿霉素組，表明阿霉素能有效抑制腫瘤的增長，其與姜黃素聯合使用后，抑制作用更顯著，證明姜黃素聯合阿霉素后，能使肝癌腫瘤對化療藥敏感性增加，具有化療藥增敏作用，且這種增敏作用可能是通過抑制腫瘤細胞的增殖、促進腫瘤細胞的凋亡而實現的。

綜上所述，姜黃素與阿霉素聯合使用后，較單獨使用阿霉素更能增加人肝癌PLC/PRF/5細胞的藥物敏感性，這種作用可能與抑制人肝癌PLC/PRF/5細胞的增殖，促進人肝癌PLC/PRF/5細胞的凋亡有關。