五味子乙素通過Traf6/TAK1信號通路介導人胃癌細胞凋亡

王金橋，鄧銀芝

0 引言

五味子乙素(Schisandrin B)主要提取于木蘭科植物五味子中木質素，前期研究已確認其具有較好的生物活性[1]，主要表現在保肝護肝，有較強抗炎、清除氧自由基、抗疲勞、增強免疫力和抗衰老等作用[2-5]。有報道，五味子乙素還表現出抗腫瘤活性，可以通過抑制上皮間質轉化而影響腫瘤細胞的侵襲與遷移，可以調節腫瘤細胞的周期和凋亡而抑制腫瘤細胞，還可以下調cyclin D1 mRNA的表達抑制腫瘤細胞[6-9]。研究表明，五味子乙素可以抑制胃癌細胞的增殖、誘導凋亡，并且可以破壞細胞間和基底膜黏附性及增強腫瘤細胞間的穩定性，起到抑制胃癌細胞轉移的能力[10-12]。但是，五味子乙素誘導胃癌細胞凋亡的作用機制尚不清楚。因此，本文以人胃癌細胞HGC27為研究對象，探討五味子乙素介導HGC27細胞凋亡發生的作用及對Traf6/TAK1信號通路的影響。

1 材料及方法

1.1 藥品、主要試劑和儀器 人胃癌HGC27細胞株購自上海素爾生物科技有限公司；五味子乙素(杭州臨安天鴻生物科技有限公司，批號：5521-65-6，純度≥98%)；CCK8試劑盒(美國Sigma公司，批號：WH1199)；Annexin-FITC凋亡試劑盒(廣州碧云天生物試劑公司，批號：P0012S-07)；Bax、Bcl-2、Traf6、TAK1、p-TAK1及β-actin抗體購自美國Sigma公司；Victor3 1420 Multilable Counter酶標儀(DX540，美國)；SDS-PAGE凝膠電泳(北京六一儀器廠，型號：DYCZ-24DN)；雙色紅外激光成像系統(BIO-RAD，美國)。

1.2 細胞培養及分組 HGC27細胞在含有10%胎牛血清的1640培養基中培養，培養條件為5% CO2、37 ℃，每隔2～3 d進行傳代培養，接種后24 h取處于對數生長期的細胞用于后續實驗。HGC27細胞分為空白對照組(A組)、12 μg/ml五味子乙素組(B組)、24 μg/ml五味子乙素組(C組)及48 μg/ml五味子乙素組(D組)。用二甲基亞砜(DMSO)溶解五味子乙素，冷凍待用。其中A組細胞加入相同體積的培養基，細胞接種24 h后，加入不同濃度的五味子乙素干預細胞，收集細胞用于各項指標檢測。

1.3 CCK8法檢測細胞增殖抑制率 HGC27細胞接種于96孔板，每組實驗設置6個復孔，當藥物干預細胞24、48、72 h后，吸去舊培養基，每孔加入10 μl CCK8試劑，于5% CO2、37 ℃培養箱中繼續培養1 h，用酶聯免疫分析儀于450 nm處測定各孔的吸光度值。

1.4 流式細胞術檢測細胞凋亡率 收集經不同濃度處理后的HGC27細胞48 h后，用無菌的PBS清洗細胞2次，2 000 r/min離心5 min后收集細胞，加入1 μl Annexin-FITC混勻后，加入5 μl Propidium Iodide混勻；避光反應5 min，上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.5 Western blot檢測細胞中Bax、Bcl-2、Trfa6、TAK1及p-TAK1蛋白表達水平 HGC27細胞經不同濃度藥物處理48 h后，消化收集細胞，提取蛋白并檢測蛋白濃度。每孔上樣30 μg進行SDS-PAGE垂直電泳，然后電轉至NC膜，脫脂奶粉封閉1 h；進行一抗孵育，用TBST洗膜，每10 min清洗1次，共洗3次，將NC膜放入稀釋好的Bax、Bcl-2、Trfa6、TAK1及p-TAK1抗體(1∶1 000稀釋)中，4 ℃搖動過夜；TBST洗膜后，將NC膜放入辣根過氧化物酶標記的二抗中(1∶3 000)，室溫孵育1.5 h；TBST洗膜3次后進行蛋白表達量分析。

2 結果

2.1 五味子乙素對HGC27細胞增殖抑制率的影響 對于同一藥物作用時間點，3種劑量的五味子乙素可以顯著抑制細胞的增殖，藥物干預組與對照組比較差異均有統計學意義(P<0.05)，并且隨著藥物濃度升高，細胞增殖抑制率增加，表現出劑量依賴性。對于同一組五味子乙素劑量而言，隨著藥物干預時間的延長，細胞增殖抑制率升高，組間兩兩比較差異均有統計學意義(P<0.05)，表現出時間依賴性。見表1。

表1 各組HGC27細胞增殖抑制率比較(%)

注：與A組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05；與C組比較，△P<0.05；與24 h時比較，▽P<0.05；與48 h時比較，▲P<0.05

2.2 五味子乙素對HGC27細胞凋亡率的影響 B組(12.88%±1.23%)、C組(19.62%±1.54%)、D組(38.40%±2.85%)細胞凋亡率顯著高于A組(1.60%±0.43%)，差異均有統計學意義(P<0.05)。藥物干預組兩兩比較，組間差異均有統計學意義(P<0.05)，并且細胞凋亡率隨著藥物干預濃度的升高而增加，表現出濃度依賴性。見圖1。

圖1 不同組別間細胞HGC27細胞凋亡情況比較

2.3 五味子乙素對HGC27細胞中凋亡蛋白表達的影響 結果表明，五味子乙素可以誘導促凋亡蛋白Bax的表達，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，并且Bax、Bcl-2表達量隨著藥物干預濃度的升高而發生顯著變化(P<0.05)，呈現出濃度依賴性。見圖2。

2.4 五味子乙素對HGC27細胞中Traf6/TAK1信號通路的影響 結果表明，五味子乙素可以顯著抑制Traf6、p-TAK1蛋白的表達，并且Traf6、p-TAK1蛋白表達量隨著藥物干預濃度的升高而顯著降低(P<0.05)，呈現出濃度依賴性，說明五味子乙素能夠顯著抑制HGC27細胞中Traf6/TAK1信號通路的活化，起到誘導細胞凋亡的作用。見圖3。

圖2 不同組別間Bax、Bcl-2蛋白表達水平的比較

注：與A組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05；與C組比較，

△P<0.05

圖3 不同組別間Traf6、p-TAK1蛋白表達水平的比較

注：與A組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05；與C組比較，

△P<0.05

3 討論

五味子乙素是從傳統中藥五味子中提取的活性物質，早期研究發現，五味子乙素具有抗腫瘤活性[6-9]，對膀胱癌、前列腺癌及乳腺癌等腫瘤具有抑制作用。但是關于五味子乙素對人胃癌細胞的增殖、凋亡等作用及其作用機制尚未得到證實。本研究探討了五味子乙素對人胃癌HGC27細胞增殖、凋亡的影響及其可能作用的機制，結果表明，不同濃度五味子乙素作用HGC27細胞后，可以顯著抑制細胞增殖和促進細胞凋亡，并且均表現出濃度依賴性，證實五味子乙素能夠降低HGC27細胞的存活率，并誘導腫瘤細胞發生凋亡。

生理條件下，細胞的增殖和凋亡保持一種動態平衡，如果這種平衡發生變化，則會引起腫瘤的發生。細胞內相關基因調控細胞凋亡的發生，然而細胞外環境因素通過膜受體介導信號傳導，影響細胞內有關基因的表達水平變化來調控細胞凋亡。較多的信號傳導通路參與到腫瘤的發生發展中。轉錄生長因子-β活化激酶1(TAK1)受外界環境因素的變化可以介導細胞信號的傳導，多種細胞因子(如IL-1、TGF-β、TLR、CD4及B細胞受體等)介導的信號均可通過活化TAK1傳導發揮相應的生物學效應[13]。研究發現，Traf6轉基因小鼠中，當Traf6表達水平上升時，可以促進TAK1的磷酸化，進而誘導細胞炎癥、凋亡及氧化應激損傷的發生[14]。本實驗結果表明，五味子乙素能明顯抑制Trfa6/TAK1信號通路的活化，主要是通過降低pTraf6和p-TAK1蛋白的表達，說明五味子乙素可以通過調控Trfa6/TAK1信號通路介導HGC27細胞的凋亡。Bax是一種促凋亡蛋白，而Bcl-2是一種抗凋亡蛋白[15]，二者在細胞凋亡調控過程中起著十分重要的作用。本研究發現，五味子乙素可以明顯誘導Bax表達，抑制Bcl-2表達，從而進一步誘導HGC27細胞凋亡。

綜上所述，五味子乙素能夠明顯抑制人胃癌HGC27細胞的增殖，促使其凋亡，其機制可能與五味子乙素抑制Trfa6/TAK1信號通路活化，繼而啟動細胞凋亡有關。