RNA恒溫擴(kuò)增實時熒光檢測技術(shù)對復(fù)治菌陽肺結(jié)核患者療效評價的研究

耿書軍，劉建玲，黨萍，馬清艷，侯莉莉，康冠楠，宋韜

復(fù)治菌陽肺結(jié)核患者因長期痰涂片陽性，傳染性較強(qiáng)，對社會危害較大，盡早消滅患者的傳染性十分必要。目前對抗結(jié)核藥物殺滅結(jié)核菌效果的檢測多采取傳統(tǒng)的羅氏培養(yǎng)法、BACTEC MGIT-960等，但成本較高，檢測時間較長，患者不能盡早獲得結(jié)果，從而使得部分患者因痰涂片持續(xù)陽性而導(dǎo)致治療不規(guī)范，喪失治療信心。近年來，RNA實時熒光恒溫擴(kuò)增檢測技術(shù)（simultaneous amplification and testing，SAT）廣泛用于支原體［1］、衣原體［2］、流感病毒［3］、腸道病毒［4］、淋球菌［5］、結(jié)核分枝桿菌［6］等方面的檢測，均取得了良好的效果。本研究利用此項技術(shù)監(jiān)測抗結(jié)核藥物的治療效果，結(jié)果滿意，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年6月—2016年12月在我科住院，臨床診斷為初次復(fù)治菌陽肺結(jié)核患者62例，其中男34例，女28例，年齡18～65歲，平均（43.31±11.54）歲。所有患者入院后均取痰標(biāo)本經(jīng)彭氏杯抗酸染色3次，至少1次抗酸染色陽性，且均符合復(fù)治肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)［7］：（1）初治失敗，痰涂片抗酸染色陽性或涂片陰性而培養(yǎng)陽性者。（2）完成規(guī)律的標(biāo)準(zhǔn)化療或短程化療后又復(fù)發(fā)者。（3）肺切除手術(shù)后出現(xiàn)新病灶或遺留病灶惡化、復(fù)發(fā)者。所有入選者均排除合并糖尿病、血液病、腫瘤、肝病、其他免疫系統(tǒng)疾病以及不能耐受結(jié)核藥物治療者。

患者入院后均給予異煙肼（INH，H）、利福平（RFP，R）、吡嗪酰胺（PZA，Z）、乙胺丁醇（EMB，E）、左氧氟沙星（LFX，V）抗結(jié)核及對癥治療。治療2個月后囑患者清晨漱口后用力咯支氣管深部痰液5～10 mL于彭氏杯中，送檢抗酸染色3次，任何1次陽性即可作為陽性，同時送檢BACTEC MGIT-960培養(yǎng)、菌種鑒定及SAT檢測，以BACTEC MGIT-960培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)，分析SAT及痰彭氏杯抗酸染色在評價結(jié)核病治療效果中的價值。

1.2 方法

1.2.1 痰涂片抗酸染色和痰結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng) 抗酸染色及BACTEC MGIT-960快速培養(yǎng)法的操作步驟均按照2013版中華醫(yī)學(xué)會、中國防癆協(xié)會制定的《結(jié)核病實驗室檢驗規(guī)程》標(biāo)準(zhǔn)［8］。

1.2.2 SAT采用結(jié)核分枝桿菌（TB）核酸檢測試劑盒（RNA恒溫擴(kuò)增，購自上海仁度公司）。取患者清晨痰液1.5 mL，視標(biāo)本性狀加入1～2倍體積的NaOH于無菌樣品管中，渦旋振蕩1 min，使痰液充分勻化，室溫放置15～20 min。取液化好的痰液樣本1 mL與樣本處理管中，13 000 r/min離心5 min，棄上清，再加入1 mL生理鹽水重新洗滌，13 000 r/min離心5 min，棄上清，加入50 μL稀釋液重懸，該樣本即為待測樣本。取50 μL待測樣本超聲處理15 min，超聲功率為300 W。取2 μL處理物加入含30 μL擴(kuò)增檢測液的潔凈微量反應(yīng)管中，將反應(yīng)管置于干熱恒溫器上60℃保溫10 min后，再置于42℃保溫5 min，同時將酶液預(yù)熱至42℃。預(yù)熱后，向每支反應(yīng)管中加入10 μL酶液，混勻后將反應(yīng)管快速轉(zhuǎn)至實時熒光定量擴(kuò)增儀中啟動反應(yīng)程序。反應(yīng)程序為熒光通道設(shè)定為FAM，每個循環(huán)為42℃1 min，共40個循環(huán)，熒光信號收集1次/min，共檢測40次。樣本曲線與閾值線交叉點位的橫坐標(biāo)讀數(shù)（檢測時間）＜40 min的樣本為陽性樣本（所有實驗操作嚴(yán)格按照試劑盒上的說明書進(jìn)行）。SAT全程操作及檢測時間約2 h。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理與統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料數(shù)據(jù)以例表示，計算痰涂片抗酸染色和SAT相對于金標(biāo)準(zhǔn)檢測結(jié)果的敏感度、特異度、預(yù)測值等指標(biāo)，采用Kappa系數(shù)評價2種方法和金標(biāo)準(zhǔn)的一致性，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.13 種方法檢測結(jié)果比較62例送檢痰中結(jié)核菌培養(yǎng)藥敏陽性49例，菌型鑒定為人型結(jié)核分枝桿菌42例，非結(jié)核分枝桿菌7例；結(jié)核菌培養(yǎng)陰性13例。復(fù)查痰涂片抗酸染色陽性32例，陰性30例；SAT檢測陽性41例，陰性21例。檢測結(jié)果見表1。

Tab.1 Comparison of the results between three detection methods表1 3種檢測方法結(jié)果比較 （例）

2.2 診斷試驗結(jié)果SAT與痰培養(yǎng)有較好的一致性（Kappa值=0.964），其敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值分別為97.62%、100%、100%、95.24%；抗酸染色與MGIT-960培養(yǎng)結(jié)果一致性較差（Kappa值=0.086），其敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值分別為54.76%、55.00%、71.88%、36.67%。

3 討論

結(jié)核病是嚴(yán)重危害人類健康的慢性傳染病。世界衛(wèi)生組織（WHO）于2016年發(fā)布的結(jié)核病全球報告［9］表明，估算2015年全球共有140萬結(jié)核病新發(fā)病例，平均發(fā)病率為142/10萬，發(fā)病數(shù)居前三位的國家為印度、印度尼西亞、中國；中國2015年估算發(fā)病數(shù)為91.8萬，占全球的8.8%，占30個高負(fù)擔(dān)國家的10%。復(fù)治菌陽肺結(jié)核一方面因發(fā)病時間長，痰涂片抗酸染色陽性，傳染性強(qiáng)，易引起患者周圍人群及家屬的恐慌，另一方面患者經(jīng)抗結(jié)核治療后因痰涂片陽性導(dǎo)致患者不能及時減少抗結(jié)核藥物，甚至還可能再增加抗結(jié)核藥物，不僅加重患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，還會因結(jié)核藥物的不良反應(yīng)，對患者身體造成較大的損害，從而使得部分患者對治療喪失信心。因此尋找一種直接快速、操作簡單、費(fèi)用合理、準(zhǔn)確率高、適于推廣的檢測方法則顯得非常必要。

SAT以結(jié)核菌的16S rRNA為檢測靶標(biāo)，通過恒溫RNA擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增靶標(biāo)片段，熒光標(biāo)記的探針與靶標(biāo)片段的擴(kuò)增產(chǎn)物雜交后釋放熒光信號，對熒光信號實時檢測，從而快速準(zhǔn)確地判斷待檢樣本中是否有結(jié)核分枝桿菌存在［10］。因其起始靶標(biāo)為RNA，由于RNA在環(huán)境中極易降解，可有效避免污染，另外RNA只在活菌中存在，故RNA恒溫擴(kuò)增實時熒光檢測技術(shù)法可作為疾病活動性及用藥之后療效監(jiān)測，以及判斷治愈與否的輔助診斷方法［11-14］。前期Cui等［15］研究發(fā)現(xiàn)SAT與BACTEC MGIT-960培養(yǎng)鑒定結(jié)核分枝桿菌的效果相當(dāng)，兩者符合率達(dá)到了95.6%。胡永領(lǐng)等［16］和王永忠等［17］均肯定了SAT在抗結(jié)核治療藥物效果檢測方面的應(yīng)用，其雖不能直接作出藥物敏感試驗，但可以較快地判斷所用藥物的療效，及時調(diào)整藥物的使用，可大大降低醫(yī)療成本。基于SAT的上述特點，筆者對復(fù)治菌陽肺結(jié)核患者進(jìn)行了上述的研究。本研究中通過對62例復(fù)治菌陽肺結(jié)核患者抗結(jié)核治療2個月后，再分別送檢痰抗酸染色、痰結(jié)核菌培養(yǎng)和SAT。以痰培養(yǎng)結(jié)果為金指標(biāo)，則SAT檢測的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值分別為97.62%、100%、100%、95.24%，與結(jié)核菌培養(yǎng)結(jié)果有較好的一致性（Kappa值=0.964）；而抗酸染色的診斷效能則較差，其與結(jié)核菌培養(yǎng)結(jié)果的一致性比較差（Kappa值=0.086）。因此，SAT對于復(fù)治菌陽肺結(jié)核患者可做為藥物療效監(jiān)測的指標(biāo)，可根據(jù)其結(jié)果及時調(diào)整用藥，是一種安全、有效、值得推廣的方法。