Synaptotagmin1在小鼠卵母細胞體外受精過程中的作用

朱秀蘭，徐麗清，阮建興，唐婷，劉風華

在不孕癥不斷增多的背景下，越來越多夫婦需要通過輔助生殖技術（assisted reproductive technology，ART）解決生育問題，體外受精-胚胎移植（in vitro fertilization and embryo transfer,IVF-ET）臨床妊娠率可高達60%～70%，但即使如此，仍有一定比例夫婦存在受精異常而導致不孕；隨著ART應用的增多，發現卵母細胞和胚胎質量、受精率等成為影響ART成功的主要因素。有研究顯示，在IVF-ET中受精率低下占IVF-ET受精總數的11.82%，其中受精完全失敗者占受精異常的47.37%［1］。Synaptotagmin1（Syt1）在神經和分泌囊泡膜富集，主要參與神經遞質和內分泌顆粒的胞吐過程［2］，但在生殖內分泌領域研究甚少。本課題組前期研究闡述了Syt1在卵母細胞減數分裂中的作用，并探討了機制［3］。本研究擬在此基礎上分析Syt1在小鼠受精過程中的作用，為闡明正常的受精和胚胎發育過程及其調控機制提供理論依據，并對目前不孕癥高發人群利用IVF-ET技術生育健康后代提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 實驗動物4～6周齡ICR品系雌性小鼠和7～8周齡ICR品系雄性小鼠（北京維通利華有限公司，SPF級）。

1.2 主要試劑和儀器 兔抗Syt1抗體（Abcam）；TMA-DPH探針（Molecular Probes）；FITC-LCA、M2/M16培養液及其他化學用品購自Sigma公司。所用Morpholino（MO）購自美國GENE TOOLS公司。激光共聚焦顯微鏡（Zeiss LSM 510 META，德國蔡斯）；活細胞實時拍攝系統（Perkin Elmer precisely Ultra VIEW VOX，Perkin Elmer，美國）。

1.3 生殖細胞的收集和培養 先注射5 IU的孕馬血清促性腺激素（PMSG）于ICR雌性小鼠，進行雌鼠的超促排卵，46～48 h后注射5 IU的人絨毛膜促性腺激素（hCG），36 h后頸椎脫臼快速處死小鼠后取出卵巢和輸卵管。收集第2次減數分裂中期（MⅡ）成熟卵母細胞，轉移至M16培養液中。頸椎脫臼法快速處死ICR品系雄性小鼠，剪開陰囊皮膚，把睪丸連同附睪提起，用眼科剪將附睪連同睪丸剪下，置于培養皿中。剪碎附睪，置于37℃、5%CO2，95%濕度培養箱30 min后收集精子。生殖細胞收集后用于體外受精、免疫熒光、Western blot和qRT-PCR、活細胞動態觀察等處理。

1.4 Morpholino、β5-tubulin-GFP和H2B-RFP mRNA注射及皮質顆粒胞吐的動態觀察MO是經過修飾的人工合成反義寡核苷酸鏈小分子，與目的基因的mRNA或（和）DNA結合，特異性抑制基因的轉錄或（和）翻譯，可作為研究基因功能的小分子工具。Syt1-MO序列：5′-GACTGGCACTCAC?CATTTTTGGTTC-3′；對照MO序列：5′-CCTCTTACCTCAgT?TACAATTTATA-3′。用無核酸酶水稀釋，工作濃度為4 mmol/L。取MⅡ期卵母細胞，注射β5-tubulin-GFP mRNA（標記紡錘體）和H2B-RFP mRNA（標記染色體）的混和物。然后MⅡ卵母細胞在含2.5 μmol/L米力農的M2培養液中培養24 h。新鮮M2培養液中洗5遍后置于新鮮M16培養液中培養，標記TMA-DPH探針，同時Srcl2孤雌激活或者與精子進行體外受精，然后放置于活細胞工作站并實時動態觀察其變化，具體操作參考文獻［3］。注射過程中卵母細胞均置于含有2.5 μmol/L米力農的M2培養液中，30 min內完成操作。

1.5 熒光定量PCR檢測Syt1 mRNA的表達 將Syt1-MO和對照MO注射后的小鼠MⅡ期卵母細胞與精子體外受精后收集受精24 h內的受精卵，Trizol法提取RNA，逆轉錄合成cDNA。按照試劑盒說明配制反應體系，在ABI 7500熒光定量PCR儀上進行檢測。上機程序為：95℃預變性2 min；95℃15 s，62℃60 s，40個循環，62℃收集熒光信號。同時給予內參GAPDH同步處理。對比內參后檢測Syt1在受精卵中的相對表達量。

1.6 Western blot檢測Syt1蛋白的表達 將Syt1-MO和對照MO注射后的MⅡ卵母細胞進行體外受精，2組收集待檢測的受精12 h和24 h的受精卵約150～200個，加入等體積2×SDS loading buffer，置于沸水中5 min，冰上冷卻后瞬時離心，存于冰上。微量加樣器上樣，恒壓90 V電泳至樣品位于濃縮膠邊緣，改為恒壓120 V電泳2.5 h；4℃條件下恒流200 mA轉膜2.5 h將蛋白轉至硝酸纖維素膜上；TBS清洗膜3次，每次10 min；膜轉至封閉液中室溫放置1.5 h；TBST清洗3次，每次10 min，膜轉移至封閉液稀釋的兔抗Syt1一抗（1∶1 000）中，4℃放置過夜，TBST清洗3次，每次10 min；膜轉移至封閉液稀釋的HRP標記二抗（1∶2 500）中，37℃放置1 h，TBST清洗3次，每次10 min。將化學發光底物滴加于PVDF膜，顯色5 min。以Syt1蛋白與內參蛋白GAPDH的IOD值的比值，即相對IOD值表示Syt1蛋白的相對表達量。

1.7 免疫熒光及激光共聚焦顯微鏡檢測受精卵皮質顆粒的表達 將注射Syt1-MO后的MⅡ卵母細胞進行體外受精，對照組注射對照MO。2組分別收集受精后不同時期（6 h和8 h）受精卵，置于含4%多聚甲醛的緩沖液中室溫固定30 min，透膜20 min，封閉1 h，然后加入1∶100的FITC-LCA，放入4℃冰箱過夜。第2天采用含0.1%Tween 20和0.01%Triton X-100的PBS洗3次，每次5 min，之后采用PI標記染色體8～15 min，PBS洗3次。最后移到載玻片上。采用激光共聚焦掃描顯微鏡檢測。每組實驗重復3次，每組共測50個細胞。

1.8 小鼠受精率分析 將Syt1-MO顯微注射于MⅡ期卵母細胞，降調Syt1的表達；對照組注射對照MO，2組分別與精子體外受精，統計2組受精原核的形成數量。分析Syt1降調后對小鼠受精率是否有影響。每組實驗重復3次。

1.9 統計學方法 采用SPSS 19.0軟件分析數據，計量資料采用均數±標準差（±s）表示，多組樣本均數比較采用方差分析，2組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠卵母細胞皮質顆粒胞吐的動態過程 活細胞動態實驗觀察顯示，皮質顆粒胞吐發生前卵母細胞有一個體積增大的瞬間（圖1中59 min 24 s），且胞吐位置相對紡錘體和染色體位置無明確位點關系，但發現部分在卵母細胞極體的位置附近，見圖1。

2.2 Syt1在小鼠體外受精后不同時間受精卵中的表達qRT-PCR結果顯示，小鼠受精后24 h內的受精卵中Syt1的表達量逐漸增加，30 min表達量最低，之后逐漸增加，見圖2。

Fig.2 The relative expression levels of Syt1 in zygotes afer mouse fertilization in vitro圖2 Syt1在小鼠體外受精后不同時間受精卵中的表達情況

2.3 Syt1降調在受精卵中的定量表達Western blot結果顯示，體外受精后12 h和24 h，Syt1-MO組受精卵中Syt1蛋白表達明顯低于對照組，Morpholino顯著降調了Syt1蛋白表達，見圖3。

Fig.3 Western blot analysis of expression of Syt1 in zygotes for 12 h and 24 h圖3 免疫印跡分析Syt1在小鼠卵母細胞受精12 h和24 h受精卵中的表達

2.4 Syt1降調后受精卵中皮質顆粒的表達 免疫熒光及激光共聚焦顯微鏡檢測結果顯示，Syt1-MO組小鼠卵母細胞受精后6 h和8 h受精卵中皮質顆粒的表達較對照組中增加，見圖4。

2.5 Syt1降調對小鼠受精率的影響 結果顯示，Syt1-MO降調后小鼠受精率（12.00%±0.43%）較對照組（53.80%±3.34%）顯著降低（n=3，t=50.215，P＜0.001）。

3 討論

3.1 Syt1用于卵母細胞受精及受精障礙研究的理論依據 卵母細胞受精是一個復雜而精細的過程［4］。精子獲能、穿過卵丘、透明帶結合與識別、頂體反應、精卵結合與融合、卵子活化以及原核形成及融合等，任何一個環節出現問題都可能導致受精失敗，其中既有卵子因素又有精子因素。Satouh等［5］觀察到精子與卵子融合瞬間和頂體反應蛋白IZUMO1的動態定位過程。Huang等［6］首次報道了人類卵子透明帶缺失病例，ZP1基因缺陷影響了卵細胞發育過程中透明帶的形成，導致精子無法與卵子正常結合，使患者最終失去生育能力。相對于受精過程的經典理論，如頂體完整的獲能精子與卵子透明帶ZP3識別，發生頂體反應并完成受精。隨著研究深入，受精理論也隨之更新，如ZP2也參與人精子與透明帶結合與識別［7-8］，卵丘細胞中發生頂體反應的精子可穿過透明帶，完成受精［9］，卵周隙中已發生頂體反應的精子同樣具有再次受精的能力［10]。因此，本研究對闡述正常受精、確定Syt1是否為受精障礙的靶標基因或因子以及為臨床IVF-ET受精障礙患者治療方案提供理論指導。

3.2 Morpholino方法在生殖領域的應用Morpholino是經過修飾的人工合成反義寡核苷酸鏈小分子，與目的基因的mRNA或（和）DNA結合，特異性抑制基因的轉錄或（和）翻譯，從而降調目的基因的表達。相比于RNAi等其他反義干擾技術，MO不會被酶所降解，在細胞內穩定性極強，而且對細胞無毒副作用，因此作為基因功能的研究工具而廣泛應用于實驗研究中。Zhang等［11］通過顯微注射MO降調CenpH的表達發現，CenpH可通過APC/CCdh1-cyclin B1通路調節卵母細胞減數分裂過程中細胞的G2/M轉變。Kaufman等［12］用此方法研究了斑馬魚生殖細胞的母源性調節。MO降調Mf152表達后引起斑馬魚胚胎的發育異常［13］。鑒于此，本研究同樣采用Morpholino顯微注射小鼠卵母細胞，結果發現其顯著降調了Syt1基因的表達。

3.3 Syt1用于小鼠受精功能研究的理論依據Syt1是神經突觸囊泡蛋白，與神經和內分泌細胞中鈣離子結合，促使神經遞質和內分泌細胞顆粒釋放，從而引起相應的生物學行為甚至導致疾病的發生［14-15］。目前Syt1在神經內分泌系統的研究更完善，但是在生殖領域研究甚少。前期研究發現Syt1與卵母細胞的皮質顆粒共定位［3］。卵母細胞皮質顆粒在受精或孤雌激活時發生的皮質反應也是基于鈣離子調控機制。在生殖醫學臨床工作中，隨著ART技術的廣泛應用，受精異常患者也趨于增多。受精正常和受精異常組患者的年齡、不孕年限、促排卵方案、獲卵數、卵成熟比例相似；受精異常組原發不孕癥比例明顯增高，伴有男性因素及不明原因患者受精異常率高［1，16］。所以在高齡、高激素水平、原發不孕、不明原因不孕和伴有男方輕中度少、弱、畸形精子癥的患者在行IVF-ET助孕時可能存在受精失敗。本研究結果顯示Syt1在小鼠受精卵中的表達逐漸增加，Syt1降調后影響了受精卵中的皮質顆粒表達及分布，并降低了小鼠的受精率，由此證實Syt1直接參與了小鼠的受精過程，為進一步了解Syt1對不孕癥受精失敗人群是否發揮作用提供指導。

總之，本研究用活細胞成像系統動態觀察了小鼠受精時皮質顆粒胞吐的動態變化過程，并證實了Syt1直接參與了小鼠受精過程，所以推測Syt1有可能作為臨床受精障礙的靶標分子，也為進一步了解正常受精過程及IVF-ET中受精障礙患者提供了理論指導。但是Syt1影響受精過程的具體機制以及在臨床中進一步的應用仍然需要深入研究。

Fig.1 The dynamic process of CGs exocytosis圖1 小鼠皮質顆粒胞吐的動態變化

Fig.4 CGs expression and distribution changes in zygotes after down-regulation of Syt1圖4 Syt1降調影響小鼠卵母細胞受精后皮質顆粒的表達