纖維蛋白原Bβ-249C/T和Bβ-854G/A基因多態(tài)性與慢性阻塞性肺疾病急性加重期的相關(guān)性研究

慢性阻塞性肺疾病(COPD)為一種常見的慢性氣道性疾病，臨床上表現(xiàn)為進(jìn)行性加重的呼吸困難，隨著疾病進(jìn)展，可以并發(fā)呼吸衰竭、肺心病等，導(dǎo)致病人死亡，預(yù)計(jì)到2020年該病將會(huì)成為全球第三位主要的死亡原因和第五位主要的致殘?jiān)騕1-5]。研究表明，病人反復(fù)急性加重是疾病進(jìn)展的主要危險(xiǎn)因素，其發(fā)作頻率約為每年2.4～3次。目前針對(duì)預(yù)測(cè)COPD急性加重(AECOPD)的生物學(xué)標(biāo)志物的研究多集中在血清炎癥因子，部分研究發(fā)現(xiàn)纖維蛋白原(Fg)水平在AECOPD病人中增高，分析可能與AECOPD病人血液黏稠度增高、存在炎癥導(dǎo)致病人血管內(nèi)皮功能受損有關(guān)。但未見Fg基因多態(tài)性和AECOPD的相關(guān)性研究的報(bào)道。目前有研究表明，F(xiàn)gBβ鏈基因的10余個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)中，F(xiàn)gBβ-249C/T和Bβ-854G/A位點(diǎn)可能與血管內(nèi)皮損傷有關(guān)[6-10]。

因此，本研究探討FgBβ-249C/T和Bβ-854G/A基因多態(tài)性與AECOPD的關(guān)系，為早期識(shí)別AECOPD高風(fēng)險(xiǎn)人群提供依據(jù)，以便臨床醫(yī)師早期干預(yù)。

1 對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象 納入標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)慢性阻塞性肺疾病學(xué)組COPD診治指南(2013年修訂版)中關(guān)于COPD的定義[1]，選擇符合診斷標(biāo)準(zhǔn)的COPD病人80例作為病例組，同時(shí)選擇年齡、性別、吸煙史與之相匹配的健康體檢者100例作為對(duì)照組。根據(jù)上一年度急性加重次數(shù)劃分亞組，其中≥2次/年為急性加重亞組，<2次/年為非急性加重亞組。病例組男51例，女29例，年齡67～71歲，平均(69.17±2.87)歲，平均吸煙(5.91±3.12)年，對(duì)照組男68例，女32例，年齡66～72歲，平均(69.00±3.12)歲，平均吸煙(5.56±4.91)年。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并嚴(yán)重肝腎疾病、惡性腫瘤及血液系統(tǒng)疾病病人；(2)合并嚴(yán)重心臟疾病及心律失常病人；(3)應(yīng)用抗凝藥物病人。

1.2 研究方法 2組病人入組后均抽取清晨空腹靜脈血檢測(cè)Fg水平，同時(shí)抗凝管采血3 mL，低滲法分離白細(xì)胞后，應(yīng)用酚/氯仿法提取DNA，應(yīng)用多聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增目的DNA，限制性內(nèi)切酶酶切擴(kuò)增產(chǎn)物，將酶切產(chǎn)物在8%(質(zhì)量濃度)非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳，檢測(cè)FgBβ-249C/T和Bβ-854G/A基因多態(tài)性位點(diǎn)的基因型。比較2組病人Fg水平及兩個(gè)位點(diǎn)基因型分布頻率及等位基因分布頻率。

2 結(jié)果

2.1 FgBβ-249C/T和Bβ-854G/A基因位點(diǎn)多態(tài)性電泳結(jié)果 PCR擴(kuò)增FgBβ-249C/T基因T純合子(T/T)產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為311 bp；C純合子(C/C)產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為249 bp和62 bp；CT雜合子(C/T)產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為311 bp、249 bp和62 bp，因62 bp的片段分子量小，泳動(dòng)速度較快，已經(jīng)跑出膠外，因此圖中未顯示。PCR擴(kuò)增FgBβ-854G/A基因A純合子(A/A)產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為114 bp；G純合子(G/G)產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為90 bp和24 bp；GA雜合子(G/A)產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為114 bp、90 bp和24 bp。因24 bp的片段分子量小，泳動(dòng)速度較快，已經(jīng)跑出膠外，因此圖中未顯示。見圖1，2。

2.2 2組血漿Fg水平比較 與對(duì)照組相比，病例組血漿Fg水平明顯增高[(275.81±49.99)mg/dL比(418.51± 154.00)mg/dL,t=7.959 ,P<0.05]。在病例組中，急性加重與非急性加重亞組比較，血漿Fg水平無明顯差異[(412.02±146.61)mg/dL比(431.26±169.76)mg/dL,t=0.5269 ,P=0.106]。

圖1 FgBβ-249C/T電泳結(jié)果

圖2 FgBβ-854G/A電泳結(jié)果

2.3 FgBβ-249及FgBβ-854基因多態(tài)類型及等位基因比較 病例組FgBβ-854 GA型突變率高于對(duì)照組(25.0%比4.0%，P<0.01)；病例組FgBβ-249 CT型突變率高于對(duì)照組CT型突變率(56.2%比27.0%，P<0.01)；FgBβ-854G/A及FgBβ-249C/T等位基因分布頻率在病例組及對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.4 各亞組間FgBβ-249及FgBβ-854基因分布頻率及突變率比較 與非急性加重亞組比較，急性加重亞組FgBβ-854G/A基因型GG型、GA型、AA型分布頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；FgBβ-249C/T基因型CT型、TT型分布頻率差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表2。

3 討論

COPD臨床上表現(xiàn)為進(jìn)行性加重的呼吸困難，病理生理上主要表現(xiàn)為進(jìn)行性加重的氣流受限。隨著疾病進(jìn)展，可以并發(fā)呼吸衰竭、肺心病等，導(dǎo)致病人死亡及殘疾，嚴(yán)重影響病人生活質(zhì)量[1-4]。

表1 FgBβ-249及FgBβ-854基因型頻率及等位基因頻率比較

注：與對(duì)照組比較，**P<0.01

表2 急性加重與無急性加重亞組間FgBβ-249及FgBβ-854基因分布頻率及突變率比較(n,%)

注：與非急性加重亞組比較，**P<0.01

在之前研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)gβ鏈基因的10余個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)中，Bβ-249C/T和Bβ-854G/A位點(diǎn)可能分別與血管內(nèi)皮損傷有關(guān)。血管內(nèi)皮受損，一方面可以導(dǎo)致體內(nèi)凝血異常，出現(xiàn)微小血栓形成，影響組織血供；另一方面，血管內(nèi)皮損傷可以引起部分炎癥因子釋放[11-14]，引發(fā)體內(nèi)炎癥反應(yīng)。AECOPD病人由于肺部及全身炎癥反應(yīng)，可以導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷及凝血功能異常，導(dǎo)致體內(nèi)高凝狀態(tài)形成。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，病例組血漿Fg水平明顯增高，這與既往研究結(jié)果一致。但在病例組中，急性加重與非急性加重亞組比較，血漿Fg水平無明顯差異，分析該項(xiàng)結(jié)果可能與病人數(shù)量較少有關(guān)。下一步研究應(yīng)進(jìn)一步擴(kuò)大研究病人數(shù)量。

FgBβ-249C/T和Bβ-854G/A位點(diǎn)導(dǎo)致的血管內(nèi)皮損傷進(jìn)一步引發(fā)COPD病人體內(nèi)炎癥反應(yīng)及凝血異常，從而出現(xiàn)惡性循環(huán)。本研究發(fā)現(xiàn)，病例組FgBβ-854 GA型突變率高于對(duì)照組(25.0%比4.0%，P<0.05)；病例組FgBβ-249 CT型突變率高于對(duì)照組(56.2%比27.0%，P<0.05)；FgBβ-854G/A及FgBβ-249C/T等位基因分布頻率在病例組及對(duì)照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與非急性加重亞組比較，急性加重亞組FgBβ-249CT型、TT型分布頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。這提示FgBβ-249C/T位點(diǎn)突變率和AECOPD相關(guān)。

因此，針對(duì)COPD病人檢測(cè)FgBβ-249C/T位點(diǎn)突變率有助于預(yù)測(cè)AECOPD風(fēng)險(xiǎn)，有助于臨床醫(yī)生及早給予干預(yù)，減少病人急性加重次數(shù)，減輕病人因急性加重導(dǎo)致的肺功能下降及住院增加的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，具有較好的應(yīng)用前景。但本研究存在以下局限性：一方面本研究為回顧性研究，未進(jìn)行前瞻性研究，需進(jìn)一步明確FgBβ-249C/T和Bβ-854G/A基因?qū)τ贏ECOPD風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)作用；另一方面，本研究入組人數(shù)偏少，有可能不能反映群體FgBβ-249C/T和Bβ-854G/A基因分布情況。因此，下一步的研究中，需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，同時(shí)開展前瞻性研究，進(jìn)一步探討FgBβ-249C/T和Bβ-854G/A基因多態(tài)性與AECOPD的相關(guān)性。