miR-320a靶向Rab11a調控非小細胞肺癌細胞增殖的研究

石少敏,趙建軍，于杜鵑,宋玉明

(吉林大學中日聯誼醫院 呼吸內科,吉林 長春130033)

非小細胞肺癌(NSCLC)是臨床常見惡性腫瘤，其發病率和死亡率均居我國所有惡性腫瘤首位[1]。盡管以吉非替尼、恩度等為代表的新型靶向藥物在NSCLC治療中取得令人鼓舞的成效，但NSCLC患者的遠期生存率仍不盡如人意[2]。因此，進一步探索NSCLC的發病機制，提高NSCLC的臨床療效是臨床亟待解決的問題。微小RNA(miRNA)是一類內源性非編碼小分子RNA，可通過靶向調控腫瘤發生發展過程中多個關鍵基因，參與細胞增殖及凋亡等病理生理過程，是腫瘤的潛在治療靶點[3]。miR-320a是新發現的miRNA成員，定位于人體染色體8p21.3上[4]。研究表明miR-320a在NSCLC的發生發展中起到類似抑癌基因的作用，但其分子機制尚未完全明確[5]。Rab11a屬于Rab小分子GTP酶家族的成員，是內吞再循環過程中的關鍵因子。既往研究證實，Rab11a表達變化可明顯影響腫瘤細胞增殖與凋亡，提示調控Rab11a表達可能是NSCLC靶向治療的新思路[6]。課題組前期利用miRNA靶基因預測軟件證實，miR-320a與Rab11a存在結合位點，提示二者可能具有靶向關系。但miR-320a是否可通過靶向Rab11a調控NSCLC細胞增殖尚未可知。本研究旨在探討miR-320a靶向Rab11a對NSCLC細胞增殖的影響，以期為臨床診療提供依據。

1 材料與方法

1.1材料人非小細胞肺癌細胞系A549購于美國模式培養物集存庫(ATCC)；RPMI1640培養基、PBS、胰蛋白酶、胎牛血清購于Gibco公司；MTT試劑盒購于博士德生物有限公司；Rab11a單克隆抗體購于美國Abcam公司；雙熒光素酶試劑盒購于美國Promega公司；Annexin V-FIFC細胞凋亡檢測試劑盒購于凱基生物；Neg-miR、si-Rab11a、pre-miR-320a、anti-miR-320a購于Ambion公司。

1.2細胞分組常規復蘇A549細胞，將細胞重懸浮于含有1%雙抗+10%胎牛血清的RPMI1640培養液中，37℃、5% CO2恒溫培養。收集對數生長期的A549細胞并接種于6孔培養板中，調整細胞濃度為5×105個/孔，細胞隨機分為4組，即Neg-miR組、si-Rab11a組、pre-miR-320a組、anti-miR-320a組，各組分別轉染Neg-miR、si-Rab11a、pre-miR-320a、anti-miR-320a，之后細胞繼續培養24 h，轉染結束后進行后續實驗。

1.3雙熒光素酶報告基因實驗運用生物學信息軟件預測miR-320a的靶基因為Rab11a(http:/ /www.targetscan.org/)。以人非小細胞肺癌細胞基因組DNA為模板，構建野生型Rab11a 3’-UTR(Rab11a-wt)質粒、突變型Rab11a 3’-UTR(Rab11a-Mut)。收集對數生長期的A549細胞，調節細胞密度至2×105cells/well，將Rab11a-wt、Rab11a-Mut與Neg-miR或pre-miR-320a共轉染至A549，將細胞37℃、5% CO2恒溫培養48 h；測定細胞熒光素酶活性，海腎質粒熒光值作為內參。

1.4Rab11a蛋白表達檢測收集各組細胞，提取細胞蛋白，測定樣品蛋白濃度，取適量樣品行SDS-PAGE凝膠電泳，轉至硝酸纖維膜，將膜置于5%封閉液4℃封閉4 h，后依次加入Rab11a單克隆抗體(1∶2 000)、二抗(1∶500)孵育，按ECL試劑盒說明書行電化學發光檢測。

1.5細胞增殖活性檢測收集各組細胞，將細胞置于37℃、5% CO2恒溫培養，分別于培養24 h、36 h及72 h時，離心棄上清每孔加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl，繼續37℃、5% CO2恒溫培養4 h，離心棄上清，加入DMSO(100 μl/每孔)，振蕩至結晶物充分溶解，采用全自動酶標儀測450 nm處吸光值(OD值)。

1.6統計學方法采用SPSS20.0對數據進行統計學分析，計量資料用均值±標準差(Mean±SD)表示，組間比較用單因素方差檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1驗證miR-320a對Rab11a的靶向作用

生物信息學工具網站http://www.microRNA.org檢測結果顯示，miR-320a與Rab11a 3’UTR之間存在結合位點(見圖1A)。雙熒光素酶報告基因檢測結果顯示，pre-miR320a與Rab11a-WT共轉染后細胞熒光活性顯著低于Neg-miR與Rab11a-WT共轉染(P<0.05)；pre-miR-320a或Neg-miR與Rab11a-MUT共轉染后細胞熒光活性比較無統計學差異(P>0.05)(見圖1B)。

(1A為miRNA靶基因預測軟件檢測結果；1B為雙熒光酶素檢測試驗結果)

注：aP<0.05，與Neg-miR組比較

圖1雙熒光素酶報告基因實驗驗證miR-320a對Rab11a的靶向作用

2.2Westernblot檢測Rab11a蛋白表達

Western blot結果顯示，轉染pre-miR-320a和si-Rab11a后Rab11a蛋白表達顯著降低(P<0.05)，轉染anti-miR-320a后Rab11a蛋白表達顯著增高(P<0.05)(見圖2)。

2.3MTT法檢測細胞增殖

MTT結果顯示，轉染pre-miR-320a和si-Rab11a后細胞增殖活性顯著降低(P<0.05)，轉染anti-miR-320a后細胞增殖活性顯著增高(P<0.05)(見圖3)。

注：aP<0.05，與Neg-miR組比較；bP<0.05，與si-Rab11a組比較；cP<0.05，與anti-miR-320a組比較

圖2各組Rab11a蛋白表達比較

圖3 各組細胞增殖活性比較

3 討論

miR-320a已被證實參與多種惡性腫瘤的發生與發展[8]。Yang等[9]研究發現，浸潤性乳腺癌組織中miR-320a表達與腫瘤大小、臨床分期、淋巴結轉移及遠處轉移有關(P<0.05)，且miR-320a表達越低者總體生存時間越短。李沛等[10]研究顯示，利用慢病毒轉染技術上調結腸癌細胞中miR-320a表達水平，可顯著抑制細胞中β-catenin、Vimentin、N-cadherin、MMP-2及MMP-9蛋白表達，同時抑制細胞增殖活性、侵襲能力及轉移能力。Zhang等[11]研究表明，NSCLC組織中miR-320a表達顯著低于癌旁正常組織(P<0.05)。上述研究提示，miR-320a在包括NSCLC在內的多種惡性腫瘤細胞中均發揮類似抑癌基因的功能，但其作用機制尚未完全明確。

受體介導的胞吞作用是動物細胞從胞外攝取大分子物質的重要方式[12]。Rab11a作為胞吞再循環的關鍵因子，參與物質胞內運輸、循環過程。研究發現，Rab11a參與惡性腫瘤的發生發展，其機制可能與Rab11a調控腫瘤細胞胞內運輸有關[13]。Dong等[14]研究證實，Rab11a在NSCLC組織中高表達，且其高表達與TNM分期、淋巴轉移及預后不良有關(P<0.05)；過表達Rab11a可顯著促進NSCLC細胞增殖、遷移和侵襲，同時抑制細胞凋亡。上述研究提示，Rab11a可能是NSCLC基因治療中的一個重要靶點。本研究結果顯示，轉染pre-miR-320a可顯著下調A549細胞中Rab11a表達，而轉染anti-miR-320a則可顯著上調A549細胞中Rab11a表達，提示miR-320a與Rab11a之間存在某種負向調控機制。進一步利用基因軟件預測和雙熒光素酶報告基因實驗證實，miR-320a可通過作用于Rab11a 3’UTR，實現對Rab11a的靶向作用。本研究還觀察到，轉染pre-miR-320a后，且隨著Rab11a表達的降低，A549細胞增殖活性顯著降低，提示過表達miR-320a可通過靶向抑制Rab11a調控NSCLC細胞增殖，反之亦然。故推測，miR-320a靶向調控其下游靶基因Rab11a是其介導NSCLC細胞增殖的主要分子機制。

綜上所述，miR-320a可通過靶向Rab11a調控NSCLC細胞增殖。但miR-320a是否還通過靶向其他多個下游靶基因參與NSCLC的發生與發展？尚未可知，仍有待進一步深入研究。