抗CD133單鏈抗體/白喉毒素DAB389融合蛋白的基因構建、表達、純化及鑒定

程金章，楊景樸，仲 煒，王海濤,趙 胤，陳俊俊，王宗貴*，牙韓盛

(1.吉林大學第二醫院，吉林 長春130041;2.吉林大學中日聯誼醫院;3.岳陽縣人民醫院)

近年來腫瘤干細胞理論的提出給腫瘤治療帶來了曙光,該理論認為:腫瘤組織中極少數的腫瘤干細胞是腫瘤發生、 耐受和轉移的根源[1,2]。 CD133被普遍認為是腫瘤干細胞表面特異性表達蛋白,可以作為多種腫瘤干細胞的標志物[3-6]。目前在喉癌中CD133被認為是人喉癌Hep-2細胞系中腫瘤干細胞的標志物[7]。我們前期研究也證實CD133+喉癌腫瘤干細胞具有化療抵抗性[8]。因此以腫瘤干細胞為靶點的治療為腫瘤患者帶來了希望。

免疫重組毒素是利用基因工程技術將天然毒素的受體結合區基因替換成可與腫瘤細胞表面分子特異結合的抗體或細胞因子基因,制備出具有特異性靶向作用的毒素分子，是腫瘤導向治療研究中的熱點之一,白喉毒素(DT)由535個氨基酸殘基組成的相對分子質量為58000 的多肽,由受體結合區、跨膜區和酶活性區3 個在空間上相互獨立的結構域組成[9]，適于進行各種基因工程操作。本研究采用基因工程技術將CD133(scFV)與白喉毒素片段(DAB389)進行融合,通過誘導、表達、純化,獲得了靶向殺傷CD133陽性腫瘤干細胞的免疫毒素DAB389-Linker-CD133(scFV),為靶向殺傷腫瘤干細胞藥物的開發奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1菌株、質粒及主要試劑

T-CD133(scFV) VH 、T-CD133(scFV) VL-linker、表達載體pET28 a(+)， BL21(DE3)，CHO(CD133+)工程細胞和CHO-S細胞由吉林大學第二醫院中心實驗室保存。pUC57-DAB389由南京金斯瑞生物科技有限公司全基因合成； NcoI (8 U/μl)、BamHI (8 U/μl)、 MunI (8 U/μl)，XhoI(8 U/μl)、T4 DNA Ligase (350 U/μl)、克隆載體pMD18T購自TaKaRa公司；質粒提取試劑盒和膠回收試劑盒購自Biomega公司。

1.2引物

DNA序列見表1。

表1 引物DNA序列

1.3目的基因構建與鑒定

按照T-CD133(scFV) VH 、T-CD133(scFV) VL-linker基因序列分別設計2條特異性引物序列(P1、P2)(見表1)分別對T-CD133(scFV) VH 、T-CD133(scFV) VL-linker進行PCR擴增，酶切后以T-CD133 VH 、T-CD133(scFV) VL-linker為模板，以P1下、P2上為引物擴增CD133(scFV) ，CD133(scFV)片段經凝膠純化后進行TA克隆得到質粒 pMD18T-CD133(scFV)。 用引物P3(見表1)對pMD18T-CD133(scFV)進行擴增。pUC57-DAB389和pET28a(+)通過NcoI/BamHI雙酶切構建pET28 a(+)-DAB389。

1.4重組表達質粒的構建與鑒定

將CD133(scFV)片段定向連接至中間載體pET28-DAB389上，構建pET28-DAB389- CD133(scFV)重組質粒。將重組質粒轉化于感受態BL21(DE3)中，構建重組菌株，提取質粒，酶切鑒定，核苷酸測序。

1.5重組蛋白的誘導表達及分析

將含有pET28-DAB389-Linker-CD133(scFV)重組質粒的菌株1∶1 000接種于4 ml濃度為50 μg/ml 卡那霉素的液體培養基中，37℃ 培養過夜。次日將上述菌液1∶100轉接于20 ml含有卡那霉素的液體培養基中，37℃培養至OD600=1，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L誘導表達，37 ℃振蕩培養4小時。離心收集菌體。分別取誘導前后的上清和沉淀進行SDS-PAGE電泳分析。

1.6重組蛋白的純化及鑒定

將重組蛋白超聲裂解后,根據Ni 柱的使用說明純化,采用透析法對蛋白進行復性，同時對表達產物進行Western blot 鑒定，純品蛋白經SDS-PAGE 電泳后,用電轉移方法將電泳膠上的蛋白轉印至硝酸纖維素膜上,進行Western blot 印跡分析。一抗為mouse-anti-His(1∶5 000)。二抗為FITC-羊抗小鼠IgG(1∶2 000)。

1.7流式細胞術檢測DAB389-linker-CD133(scFV)的靶向性

首先用CD133單克隆抗體檢測CHO(CD133+)工程細胞和CHO-S細胞的CD133表達率。然后用CHO(CD133+)工程細胞和CHO-S細胞檢測DAB389-linker-CD133(scFV)的靶向性。陰性對照組分別為單獨CHO(CD133+)細胞和CHO-S細胞，細胞加二抗對照組，細胞加一抗、二抗對照組。一抗為mouse-anti-His(1∶5 000)。二抗為FITC-羊抗小鼠IgG(1∶2 000)。收集細胞，每管5×105個，用PBS洗滌；加入免疫毒素DAB389-linker-CD133(scFV)，用PBS稀釋至終濃度范圍為10 μg/ml、20 μg/ml、40 μg/ml，測定CD133表達率。

2 結果

2.1DAB389-Linker-CD133(scFV)原核表達載體的構建與鑒定

重組質粒pET28-DAB389-Linker-CD133(scFV)通過NcoI/ BamHI雙酶切后通過瓊脂糖凝膠電泳進行酶切鑒定，酶切片段大小為1 891 bp,與預期相符，說明重組質粒構建成功，核苷酸序列分析正確，與理論值一致。

2.2目的基因的誘導表達及SDS-PAGE電泳分析

通過對菌種 BL21(DE3)/pET28-DAB389-Linker-CD133(scFV)進行小量誘導后， SDS-PAGE電泳檢測表明，構建的重組菌株能高效地表達重組蛋白，相對分子量大小約66 KDa。而空菌對照組和未誘導組均未見相應表達帶,表明該重組菌表達了DAB389-Linker-CD133(scFV)融合蛋白。見圖2。

2.3DAB389-Linker-CD133(scFV)蛋白純化及westernblot鑒定

通過對粗蛋白DAB389-Linker-CD133(scFV) 進行Ni柱的純化制備，得到精蛋白， SDS-PAGE凝膠電泳顯示蛋白分子量大小約為66 kDa， AlphaImager 1220 v5.5軟件分析純度為95%。通過Ni-NTA親和純化、透析復性、超濾濃縮的蛋白終產品 DAB389-Linker-CD133(scFV) 進行SDS-PAGE和Western blot實驗，證明所表達制備的蛋白與設計的一致。見圖3。

1 空菌;2 誘導后上清;3誘導前沉淀；4 誘導后沉淀檢驗 注：1.SDS-PAGE電泳；A Western blot

圖1DAB389-Linker-CD133(scFV)表達圖2SDS-PAGE電泳結果圖3載體的酶切鑒定純化重組蛋白復性后SDS-PAGE電泳及Westernblot檢驗

2.4流式細胞術檢測DAB389-linker-CD133(scFV)的靶向性

用CD133單克隆抗體檢測CHO(CD133+)工程細胞和CHO-S細胞的CD133表達率，CHO工程細胞CD133表達率為86.78%，CHO-S細胞的CD133表達率為13.94%。DAB389-Linker-CD133(scFV)濃度為20 μg/ml時與CHO工程細胞和CHO-S細胞的結合率分別為41.3%，和7.87%。實驗證實重組蛋白DAB389-Linker-CD133(scFV) 對CD133陽性細胞具有較強靶向性。見圖4。

3 討論

目前越來越多的證據表明腫瘤細胞具有異質性，存在著極少量的腫瘤干細胞，與腫瘤的增殖、復發、轉移和對放化療抵抗關系密切。傳統治療方法雖使腫瘤細胞總數量減少，腫瘤體積縮小或臨床診斷消失，但殘留下的腫瘤干細胞可以逃逸抗腫瘤藥物，最終導致腫瘤復發和轉移擴散。

圖4 流式細胞儀檢測重組蛋白與CHO(CD133+)、CHO-S細胞結合活性

CD133是位于細胞膜表面具有5個跨膜區的糖蛋白，分子量為117 kD。CD133最初在造血干或祖細胞中發現，在內皮前體細胞和神經前體細胞中經常有表達，而在成熟的血細胞、內皮細胞以及神經細胞則沒有表達。CD133表達的重要特征是隨著細胞的分化而迅速下降，這也使CD133成為分離干細胞和腫瘤干細胞的特異性分子標記[10]。CD133在腦腫瘤、肝癌、前列腺癌、結腸癌、喉癌等多種實體瘤干細胞研究中發揮了重要作用[3-8,11]。因此本研究瞄準腫瘤干細胞，以CD133為靶點，利用scFV 將抗體重鏈可變區和輕鏈可變區通過柔性軟肽連接，具有良好的靶向性，降低了免疫原性。構建具有靶向CD133的優良遞送藥物載體，與免疫毒素融合構成具有多重功能的融合蛋白，以達到與腫瘤干細胞特異性結合殺傷的目的[12]。研究中最常應用的免疫毒素有白喉毒素、假單胞桿菌外毒素、蓖麻毒素等[13,14]。 DAB389作為白喉毒素的酶活性區,它通過阻止延長因子-2 在核糖體內促進多肽鏈延長而抑制蛋白質合成造成細胞死亡,具有極強的細胞毒性,是靶向毒素常用的毒素分子。

本研究用基因工程原理和方法，將CD133/(scFV)和DAB389通過Linker進行連接，成功構建了免疫毒素DAB389-Linker-CD133(scFV) 的重組表達質粒。重組表達質粒經誘導表達后，蛋白電泳證實有與預期分子量大小相符的蛋白產生，經鑒定為目的蛋白，經過親和層析獲得純化的免疫毒素DAB389-Linker-CD133(scFV)，透析復性后獲得具有活性的DAB389-Linker-CD133(scFV)。通過對CHO(CD133+)和CHO-S細胞的靶向性實驗，證實DAB389-Linker-CD133(scFV)對表達CD133抗原具有良好的靶向性。

DAB389-Linker-CD133(scFV)有望對CD133+腫瘤干細胞進行靶向殺傷，以提高放化療的敏感性。為進一步研究開發針對腫瘤干細胞的靶向殺傷藥物奠定了理論基礎。