住院腹瀉患兒杯狀病毒感染特征分析

姜洪波,孟婷玉,孫利偉*,田玉玲,王承訓,趙艷玲,賀 巖,黃艷智,黎偉明,李 響

(1.長春市兒童醫院,吉林 長春130051；2.吉林省疾控中心)

杯狀病毒為杯狀病毒科單股正鏈RNA病毒，國際病毒分類委員會將其分為4個屬，其中諾如病毒(NoV)和札如病毒(SaV)兩個屬主要感染人類[1]，統稱為人類杯狀病毒(HuCV)。HuCV在全球廣泛分布，是引起兒童及成人非細菌性急性胃腸炎的常見病原，自1972 年發現諾瓦克病毒[2]以來曾引起多次大的爆發流行[3-5]。諾如病毒是全球急性胃腸炎散發病例和暴發疫情的主要致病原，疾病負擔嚴重[6]；每年可導致約6.85億人次急性胃腸炎發作，近30%為5歲以下嬰幼兒，導致5萬患兒死亡[7]。我們依托國家和吉林省CDC病毒性腹瀉監測項目對住院腹瀉患兒HuCV感染情況進行系統監測，現報告長春市兒童醫院2013-2017年腹瀉住院患兒HuCV感染病原及臨床特點。

1 對象與方法

1.1研究對象2013年1月-2017年12月因腹瀉住院患兒2272例。納入標準：腹瀉發病時間小于等于7天；年齡小于等于60月齡；大便以稀水樣或蛋花湯樣為主，每日排便次數≥3次；伴或不伴有嘔吐。排除標準：腹瀉大便膿血性；便常規檢出大量白細胞，或膿細胞；臨床高度懷疑細菌性腸炎者。

1.2方法參照國家疾病預防與控制中心病毒所“腹瀉監測方案”相關方法。

1.2.1標本的采集及處理 患兒入院當天采集糞便標本約5 ml,制備成10%的便懸液，-40℃備用。

1.2.2核酸提取 采用Geneaid 病毒核酸提取試劑盒。

1.2.3HuCV核酸檢測 AMV逆轉錄酶為 Promega 公司產品，Taq 酶、PCR反應液、RNasin 為TaKaRa 公司產品；引物序列參考“腹瀉監測方案”，序列見表1。①逆轉錄，反應體系25 μl，包括：10xBuffer 2.5 μl，1%BSA 2.5 μl，2.5 mmol/L dNTPs 5.0 μl，25 mmol/L MgCl24.0 μl，混合 289H,I 引物(0.2 μg/μl)1.0 μl ，40 U/μl RNasin 0.1 μl，10 U/μl AMV-RT 0.35 μl ，模板RNA1.5 μl，dH2O 8.05 μl。反應條件42℃，1 h。②PCR反應體系50 μl，包括：10xBuffer 5.0 μl，25 mmol/L MgCl24.0 μl，10 mmol/L dNTPs 1.0 μl，混合 289H,I 引物(0.2 μg/μl)1.0 μl ，混合 290H,I,J,K 引物(0.1 μg/μl)1.0 μl，5 U/μl Taq 酶0.4 μl，ddH2O 29.6 μl。反應條件94℃ 3 min→(94℃ 1 min→58℃ 1 分 20 s→72℃ 1 min)×30→72℃ 10 min。

表1 人杯狀病毒檢測的引物序列

1.2.4結果判定 PCR產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，NoV條帶大小為 319 bp，CaV條帶大小為 331 bp。

1.2.5HuCV基因型分析 應用核酸序列檢測及分析方法，PCR陽性標本送測序公司進行測序，并于NCBI GenBank中NoV和CaV標準參考株比對確定基因型。

1.3統計學分析

患兒流行病學資料及實驗數據采用EpiData3.1軟件錄入，應用Excel 2010對病例進行描述性分析，計數資料用百分率(%)表示；用SPSS 19.0 軟件進行卡方檢驗。P<0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1HuCV檢出情況

2.1.1HuCV陽性檢出率 2013-2017年共采集腹瀉住院患兒糞便標本2272份,381份檢出HuCV，HuCV總陽性檢出率16.77%；2013、2014、2015、2016和2017年不同年份HuCV 陽性檢出率分別為17.49%(67/383)、12.28%(55/448)、13.55%(66/487)、16.75%(67/400)和22.56%(125/554)。HuCV陽性檢出率3-4年一個高峰，而且近年有增高趨勢，如圖1。

圖1 長春市兒童醫院腹瀉住院患兒HuCV陽性檢出率

2.1.2HuCV屬和基因型 381份HuCV ，366份為 NoV，15份為SaV；NoV基因型93.17%(341/366)為GⅡ，詳見表2。長春市兒童醫院腹瀉住院患兒杯狀病毒感染可見NoV與SaV，NoV基因分組可見GⅡ、GⅠ和GⅠ/GⅡ，以NoV的GⅡ為主。

表2 2013-2017年HuCV屬和基因型分布

2.2HuCV陽性患兒流行病學特點

2.2.1年齡分布 381份HuCV陽性患兒年齡最小2月齡，最大54月齡，平均年齡(15.28±10.08)月齡。長春市兒童醫院腹瀉住院患兒HuCV感染以7-12月齡組病人最多(36.76%),其次為13-24月齡組(32.28%)，≤24月齡組占陽性患者的83.20%，詳見圖2。經卡方檢驗，腹瀉住院患兒HuCV感染年齡分布存在明顯差異，χ2=13.53,P=0.019。

圖2 長春市兒童醫院住院腹瀉患兒HuCV年齡分布

2.2.2性別分布 在2272例腹瀉患兒中，男性1342例，其中HuCV感染占16.69%(224/1342)；女性930例，其中HuCV占16.98%(158/930)；腹瀉住院患兒HuCV感染率男女性別無明顯差異，(χ2=2.791,P=0.095)。

2.2.3城鄉分布 腹瀉住院城市患兒1054例，鄉村患兒1218例； HuCV感染城市患兒167例，鄉村患兒214例，腹瀉住院患兒HuCV感染鄉村多于城市，但無明顯差異，(χ2=1.205,P=0.272)。

2.2.4季節分布 住院腹瀉患兒HuCV感染一年四季均可發生，2013-2017年總陽性檢出率一年有兩個高峰，1-3月和12月，不同年份檢出率有所不同，見圖3；連續分析2013-2017年HuCV感染情況，2013年無明顯高峰，2月和4月病例數最多；2014年2-3月、5月和12月 均出現高峰；2015年1月、4-5月和12月3個高峰；2016年1-3月和12月2個高峰；2017年1-3月和12月2個高峰；從2014年開始每年12月至次年1月-3月為腹瀉住院HuCV 感染的高峰季節，見圖3。

圖3 長春市兒童醫院腹瀉住院患兒HuCV感染季節分布

2.3HuCV感染臨床特征

381例腹瀉住院HuCV感染患兒均有腹瀉，平均每天腹瀉(4.75±2.77)次。241例伴有嘔吐，占比為63.25%。58.79%(224/361)伴有不同程度體溫升高,其中14.44%(53/381)體溫≥38.5℃。出現呼吸系統癥狀者占46.72%(178/381)；2.01%(8/381)出現抽搐。平均住院天數為(3.6±2.7)天。

3 討論

我國1995年首次報道腹瀉患兒糞便標本中有NLV感染[10]。HuCV是世界范圍內急性病毒性腹瀉的主要病原之一，是我國多數地區5歲以下小兒急性病毒性腹瀉僅次于輪狀病毒的致病源[11-13]；是部分地區腹瀉某一時間段的第一位病原[14],多地報道HuCV感染有上升趨勢[15]，這可能與近年輪狀病毒疫苗的使用有關。本研究顯示長春市兒童醫院2013-2017年腹瀉住院患兒HuCV 陽性檢出率分別為17.49%、12.28%、13.55%、16.75%和22.56%,總陽性檢出率為16.77%。長春市1998-2001年HuCV 陽性檢出率為14%[16]，2003年-2007年HuCV陽性檢出率為18%[17]，2008-2012年HuCV陽性檢出率14.0%[18]。HuCV陽性檢出率3-4年一個高峰，而且近年有增高趨勢。長春市兒童醫院腹瀉住院患兒杯狀病毒感染可見NoV與SaV，NoV基因分組可見GⅡ、GⅠ和GⅠ/GⅡ，以NoV的GⅡ為主。目前國內外對NoV研究較深，報道亦較多。吉林省HuCV感染也以NoV為主；SaV感染率雖然很低(3.94%)，但是呈現逐年增多趨勢。以往由于SaV臨床表現較NoV輕和SaV基因型的多樣性，受檢測方法的限制，還有SaV造成隱性感染者多極少就醫，故SaV流行情況報道相對較少。近年國外對SaV流行的報道較多[19-21],目前SaV已在多個國家的急性胃腸炎病例樣本中檢出，檢出率為1.2%-17.6%[22]。應加強對SaV流行情況的監測，深入研究其基因變化，了解其感染機制和發病機理，為可能出現的SaV暴發疫情預測和預警。

本研究長春市兒童醫院腹瀉住院患兒HuCV感染83.20%為≤24月齡嬰幼兒，感染高發年齡段為7-12月齡組腹瀉患兒，這與國內多家報道相同[15,23]。小兒生后母體的免疫球蛋白含量逐漸減少，6月后基本消失，此時自身的抗體水平也較低。這時對病原微生物感染抵抗力最小，易患各種病毒感染；2歲以內嬰幼兒腸道正常菌群還沒健全，生物屏障尚未形成，故≤24月齡嬰幼兒為HuCV易感人群。HuCV感染男性略多于女性，鄉村略多于城市。長春市兒童醫院腹瀉住院嬰幼兒HuCV感染高發季節，2013-2017年為12月至次年1-3月；與1998-2001 年[16]和2003-2007年[17]相似；而2008-2012年為1-4月[18]。以上報道顯示長春市兒童醫院腹瀉住院患兒HuCV感染發病高峰為寒冷季節。HuCV感染高發季節在成都是夏秋季[15]，廣西是8-10月[24]。提示HuAC腹瀉發病高峰不同地域存在差異。東北地區預防HuCv感染重點應在寒冷季節，同時不能忽視夏秋季食源性HuCV感染的爆發流行。

長春市兒童醫院腹瀉住院患兒HuCV感染的臨床特點是63.25%伴有嘔吐，58.79%有不同程度體溫升高。提示人們：在腹瀉患兒中2/3出現嘔吐和發熱時，應警惕HuCV感染，并做相應的檢測。長春市兒童醫院腹瀉住院HuCV感染患兒46.72%伴有呼吸系統癥狀，接近深圳報道HuCV感染42.86%有呼吸系統癥狀[25]；2.01%(8/381)出現抽搐，國內有報道腹瀉抽搐發生率約為1.78%[26]。HuCV感染多數患兒癥狀輕、具有自限性，也有報道嬰幼兒HuCV感染出現多器官損害[25]等嚴重并發癥。

隨著分子生物學技術的發展，新的檢測技術的不斷涌現，HuCV的重要性和危害性逐漸被人們全面認識，通過加強HuCV感染的基礎研究和流行病學監測，可為HuCV感染的預防、治療和疫苗研發提供科學依據。