Fra-2基因在喉鱗狀細胞癌中的表達研究

張云龍，宋曉飛，段云靜，趙輝明，趙瑞力

(1.石家莊市第一醫院 重癥醫學科三病區，河北 石家莊050011；2.河北省人民醫院 耳鼻喉科；3.石家莊市第一醫院 耳鼻喉科；4.河北醫科大學第四醫院 耳鼻喉科)

喉癌是耳鼻咽喉-頭頸外科常見的惡性腫瘤，其中以鱗狀細胞癌最為多見。有關喉癌發生機制至今尚不清楚。隨著分子生物學領域的不斷進展，癌基因激活和抗癌基因失活在致喉癌病因研究中備受關注。Fra-2屬原癌基因，一定條件下，可被激活轉變為癌基因，發揮致細胞惡性轉化的功能。先前研究顯示，永生化的惡性角質上皮細胞高表達磷酸化的Fra-2[1]。近年研究顯示，在乳腺癌、子宮內膜癌等多系統腫瘤中均可檢測到Fra-2基因的高表達[2]，而這種基因在喉鱗狀細胞癌(LSCC)中的研究尚未見報道。本研究通過免疫組化及RT-PCR法對Fra-2基因在喉鱗狀細胞癌以及癌旁正常組織當中的表達情況，進一步研究它在癌組織當中表達與各臨床病理參數之間的關系。

1 材料與方法

1.1材料

本院2012至2015年間行喉癌切除術患者的標本，取喉鱗狀細胞癌標本47例，對應的癌旁正常組織21例。嚴格按照實驗設計及評定標準分組(表1)：病理分級組中，高分化包括G1和G2，低分化為G3；臨床分期組主要基于(UICC)TNM分類標準；在淋巴結分組當中，N+代表出現淋巴結轉移的患者，N0代表未出現淋巴結轉移的患者；吸煙組當中，煙齡(年)與每日吸煙量(支)乘積大于等于四百為陽性，小于四百為陰性；解剖分區組則根據腫瘤的生長范圍分成聲門上區及聲門區。

1.2方法

免疫組化SP法按試劑盒說明操作。Fra-2 鼠抗人單克隆抗體Sc-166102購自美國Santa Cruz Biotechnology 公司。二抗免疫組化試劑盒型號(SP-9002)以及DAB液ZLI-9032購自北京中杉金橋生物技術公司。RT-PCR方法：嚴格按照試劑盒說明書步驟進行，將組織提取并檢測RNA后，反轉錄為cDNA，后行擴增，將最終產物放入凝膠行電泳完畢后攝像觀察。RNA提取所用TRIzol 購自美國SBS公司，RT-PCR 試劑盒購自美國Promega公司，DNA Maker 購自北京索來寶科技有限公司，PCR 引物購自上海生工生物工程有限公司， Fra-2上游引物(5’→3’)GAAGAGGAGGAGAAGCGTCG,下游引物(5’→3’)CTCGGGGCTAATCTTGCACA。GAPDH為內參照，上游引物(5’→3’)AGGTGAAGGTCGGAGTCAACG,下游引物(5’→3’)AGGGGTCATTGATGGCAACA。

1.3結果判定

免疫組化結果評分方法[3]：將染色強度 (intensity，I)及陽性細胞百分率(percentage，P) 均分級評分。最終組織學評分(histologiescore，H)=I×P。結果： 0-3分為低表達，4-6分為中度表達，7-9分為高表達。其中，低表達計為陰性，中表達以及高表達計為陽性。RT-PCR主要使用的軟件為Gel work-2ID行結果分析，其中使用的參數為目的基因電泳圖像當中條帶光密度值分別除以GAPDH所對應的光密度值，所得數值代表的是基因相對表達強度。

1.4統計方法

2 結 果

2.1免疫組化結果

Fra-2蛋白陽性染色呈棕色，片狀或彌漫性分布于細胞核、細胞漿(圖1)。癌組織中表達陽性率70.2%(33/47)，癌旁組織中為 33.3%(7/21)。兩者之間存在的統計學差異顯著(χ2=8.150，P<0.05)(表2)。取喉鱗癌組織分析Fra-2基因蛋白表達和多個臨床病理參數中組差異具體參見表1， Fra-2基因蛋白表達在臨床分期組和淋巴結轉移組中經統計分析存在差異顯著(P<0.05)，吸煙組對比分析差異非常顯著(P<0.01)；然而卻在病理分級、患者年齡、解剖分區組內對比無差異(P>0.05)。

A為癌旁正常組織(×400)，B為喉鱗癌組織(×400)圖1 免疫組化Fra-2基因在癌旁正常組織及喉鱗癌組織中表達表1 喉鱗癌組織中Fra-2蛋白和mRNA在各臨床病理參數組中表達

臨床參數nFra-2蛋白例(%)PmRNA(x—±s)P病理分級 G1+G23725(67.6)0.7000.33±0.330.001 G3108(80.0)0.75±0.41臨床分期 Ⅰ+Ⅱ189(50.0)0.0170.35±0.390.368 Ⅲ+Ⅳ2924(82.8)0.46±0.38淋巴結轉移 N+2622(84.6)0.0160.51±0.430.450 N02111(52.4)0.30±0.30吸煙 陽性3832(84.2)0.0000.45±0.410.246 陰性91(11.1)0.28±0.23年齡/歲 <60159(60.0)0.3240.31±0.330.214 ≥603224(75.0)0.47±0.41解剖分區 聲門上區2117(81.0)0.1480.40±0.410.792 聲門區2616(61.5)0.43±0.38

表2 喉鱗癌及癌旁正常組織中Fra-2蛋白和mRNA的表達

2.2RT-PCR檢測結果

Fra-2 mRNA 在喉鱗狀細胞癌以及癌旁組織當中的表達具體參見圖2，表達量分別為(0.42±0.39)、(0.07±0.06)，兩者對比分析差異非常顯著(P<0.01)(表2)。癌組織中，Fra-2基因mRNA 表達在多個臨床病理參數組別中的對比分析結果見表1。表中呈現的Fra-2基因mRNA表達僅在病理分級組中差異非常顯著(P<0.01)，而其他組中(臨床分期、淋巴結轉移、患者年齡、吸煙習慣、解剖分區)差異無意義(P>0.05)。

圖2喉鱗癌及癌旁組織中Fra-2mRNA水平表達電泳圖像，其中單數(1、3、5、7)為喉鱗癌電泳圖，雙數(2、4、6、8)為癌旁正常組織電泳圖

3 討論

Fra-2基因為轉錄因子AP-1(activator protein 1)家族中Fos 亞家族中的成員[2]。可激活EGF-R、PI3K和MAPK等信號通路并通過多種途徑誘導細胞增殖、凋亡抑制[4]。

本實驗發現Fra-2的蛋白和mRNA水平在喉鱗癌組織中的表達均高于癌旁組織，統計學分析差異有非常顯著意義。提示Fra-2均參與了腫瘤的發生、發展。Risto[4]等在對前列腺癌PC-3和DU-145兩個細胞系進行培養、輻射、增殖等試驗研究時，發現Fra-2通過非獨立因素激活PI3K通路促進細胞增殖能力增強。另有研究示，AP1家族中的Fra-2基因，可促進MAPK磷酸化從而活化此通路，繼而發揮激活目標基因啟動子增加細胞轉錄功能[5]。這些實驗表明Fra-2具有促進細胞增殖、惡性轉化潛力。

關于Fra-2基因在LSCC組織蛋白水平中的表達，在淋巴結轉移方面(相比于N0組來說，N+組顯著更高)，臨床分期方面(相比Ⅰ、Ⅱ期患者來說，Ⅲ、Ⅳ期患者顯著更高)，吸煙習慣方面(相比于陰性組患者來說，陽性組患者顯著更高)，差異均存在顯著或非常顯著統計學意義。在 mRNA水平方面只有病理分級(低分化組高于高、中分化組)，差異對比分析有非常顯著統計學意義。臨床參數中淋巴結轉移、吸煙、年齡，組內對比差異均無統計學意義。Wang JunFeng等[6]選取人肺癌A549細胞系，通過細胞轉染、免疫組化、Western blotting、qRT-PCR等技術行實驗分析，證明Fra-2通過與Smad3相互作用促進TGF-b1誘導的非小細胞肺癌細胞轉移。Tomonori Higuchi等[7]運用基因敲除技術證實，Fra-2/Jund異源二聚體可結合SOX4的AP-1位點，促進基因表達增加，進而促進成人T細胞淋巴瘤發展。以上結論與我們研究結論(淋巴結轉移組的蛋白水平相比于無淋巴結轉移組來說顯著更高，臨床分期中處于Ⅲ、Ⅳ期的患者，其蛋白水平相比于Ⅰ、Ⅱ期的患者來說顯著更高)相同。有關Fra-2基因吸煙陽性組表達相比于吸煙陰性組來說顯著更高，Erin Gensch等[8]研究發現香煙煙霧可使EGFR-JNK/ERK通路磷酸化，進而活化JunD/Fra-2異源二聚體，促進下游MUC5AC表達增多。而Zhang ziqiang[9]等通過質粒轉染肺腺癌細胞系，行Real-time quantitative PCR及Western blot分析，結果MUC5A表達增多者，肺腺癌轉移能力增強。綜合研究結果表明吸煙煙霧可通過激活Fra-2的上下游通路促進惡性細胞轉移。Shilpi Gupta等[10]通過對舌癌組織、癌前病變組織、正常舌組織、舌癌細胞株分別進行RT-PCR 及Western blotting實驗分析，與舌癌前病變及正常舌組織相比，舌癌組織及舌癌細胞株有較高的c-fos/Fra-2轉錄水平，并證明此異源二聚體過多表達可促進舌組織細胞異型性增加。此結論與我們研究的(mRNA水平僅病理分級低分化組高于高、中分化組)吻合。以上文獻報道顯示，Fra-2基因可通過間接或與其他因子結合形成異源二聚體共同作用促進腫瘤發生、惡化及轉移能力。

Fra-2作為原癌基因，在惡性腫瘤中的作用越來越受到關注。本實驗研究，喉鱗癌組織中Fra-2 基因的表達顯著增高，并通過對比多種臨床參數分析此基因活化表達增多可通過多種途徑參與喉癌的發生、發展，檢測喉癌組織中Fra-2的表達水平對喉癌的早期診斷及為分子生物學靶向治療提供重要參考價值。