HPLC法用于溫腎消腫丸中毛蕊花糖苷的含量測定

唐安福 崔恩忠 貢磊 湯淏 王曙東 龔光明

[摘要] 目的 建立溫腎消腫丸中毛蕊花糖苷的含量測定方法。 方法 采用高效液相色譜法，流動相：乙腈-0.8%冰醋酸（19∶81）；色譜柱：Hedera-ODS-2 C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流速為1.0 mL/min，檢測波長為334 nm，柱溫為25℃；進樣量：10 μL。 結果 毛蕊花糖苷在6.33～101.28 μg/mL范圍內呈良好的線性關系，平均回收率為100.06%（RSD = 1.51%）。 結論 該方法簡便、可靠，且重現性好，可用于溫腎消腫丸的定量控制。

[關鍵詞] 溫腎消腫丸；毛蕊花糖苷；高效液相色譜法

[中圖分類號] R284.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）06（c）-0108-04

[Abstract] Objective To establish a method for the verbascoside content determination in Wenshen Xiaozhong Pills. Methods High performance liquid chromatography method was used with Hedera-ODS-2 C18 column （250 mm×4.6 mm， 5 μm） and a mobile phase of acetonitrile-0.8% glacial acetic acid （19∶81）. Flow rate was 1.0 mL/min， the detection wave length at 334 nm， column temperature was 25℃ and sample loop volume was 10 μL. Results The calibration curve was linear within the range of 6.33-101.28 μg/mL of verbascoside， the average recovery was 100.06% （RSD = 1.51%）. Conclusion This method is simple， reliable and repeatable， which can be used for the quantitation control of Wenshen Xiaozhong Pills.

[Key words] Wenshen Xiaozhong Pills； Verbascoside； High performance liquid chromatography

溫腎消腫丸為南京軍區南京總醫院（以下簡稱“我院”）解放軍腎臟病研究所研制的醫院制劑，處方由車前子、赤芍等共11味中藥組成，具有溫腎消腫、健益脾胃的功效，臨床主要用于治療各種慢性腎炎、腎病綜合征、下肢浮腫、困怠少食，長期應用不引起電解質紊亂[1-3]。原質量標準僅采用薄層色譜法（TLC）對部分藥味進行薄層色譜鑒別，缺少對方中藥效成分的含量控制[4-7]。本研究通過高效液相色譜法（HPLC），建立制劑中毛蕊花糖苷的含量測定方法，以進一步完善其質量標準，提高該制劑的質量標準。

1 儀器與材料

Waters高效液相色譜儀、2487型紫外檢測器（美國Waters公司）；十萬分之一電子天平（XS105型，梅特勒爾-托利多公司）；數顯恒溫水浴鍋（HH-6型，國華電器有限公司）。

毛蕊花糖苷（110715-200212）購自中國食品藥品檢定研究院；溫腎消腫丸為我院制劑科生產（批號為140409、140618、140923、141219、150218）。

甲醇（美國天地）為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 方法

2.1.1 色譜條件與系統適應性試驗 Waters 1525高效液相色譜儀（雙泵），2487紫外檢測器；色譜柱：Hedera-ODS-2 C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.8%冰醋酸（19∶81）；檢測波長：334 nm；流速：1.0 mL/min；進樣量：10 L。毛蕊花糖苷的保留時間約為11.6 min。

2.1.2 溶液的制備 對照品溶液的制備：精密稱取毛蕊花糖苷對照品2.53 mg，置于25 mL量瓶中，加無水甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻后即得。供試品溶液的制備：取本品細粉1.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入無水甲醇100 mL，稱定重量，加熱回流30 min，放冷，再稱定重量，用無水甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。陰性樣品溶液的制備：取溫腎消腫丸處方飲片（除去車前子），按處方比例稱取后，制成溫腎消腫丸缺車前子的陰性樣品，并按照上述供試品溶液的制備方法，制備成陰性樣品溶液。

2.2 結果

2.2.1 專屬性試驗 精密吸取上述對照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液各10 L，按上述“2.1.1”項下方法進行測定[1-2]。見圖1。結果表明，供試品色譜在與對照品色譜相應保留時間處，有同一色譜峰，而陰性樣品溶液無峰，表示無陰性干擾成分。

2.2.2 毛蕊花糖苷的線性關系 分別精密量取上述“2.1.2”項下對照品溶液0.625、1.250、2.500、5.000 mL至10 mL容量瓶中，用無水甲醇稀釋至刻度。按“2.1.1”項下方法測定，記錄毛蕊花糖苷的峰面積值，以對照品濃度（g/mL）為橫坐標（X），峰面積值（A）為縱坐標（Y），進行線性回歸。見表1、圖2。結果表明，毛蕊花糖苷在6.33～101.28 g/mL濃度范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

2.2.3 精密度試驗 取“2.1.2”項下的毛蕊花糖苷對照品溶液，按上述“2.1.1”項下色譜條件，連續進樣5次[3-5]，記錄毛蕊花糖苷峰面積分值，并計算其RSD值為1.46%。結果表明，該方法精密度良好。

2.2.4 穩定性試驗 取溫腎消腫丸同一批號樣品，按上述“2.1.2”項下方法處理后，在上述“2.1.1”項下色譜條件下，常溫時分別于0、1、2、4、8 h進樣測定[6-8]，記錄毛蕊花糖苷峰面積值，并計算其RSD為0.91%。結果表明，樣品溶液在8 h內穩定性良好。

2.2.5 重復性試驗 稱取溫腎消腫丸同一批號樣品，共5份，按上述“2.1.2”項下方法處理后，在上述“2.1.1”項下色譜條件下進樣測定[9-11]，并計算毛蕊花糖苷的含量和RSD值為1.24%。結果表明，該方法重復性良好。

2.3 加樣回收率試驗

取毛蕊花糖苷對照品，精密稱取4.92 mg于50 mL容量瓶中，加無水甲醇并稀釋至刻度，搖勻，即得對照品儲備液。另取已知含量的溫腎消腫丸樣品（毛蕊花糖苷含量為0.9364 mg/g），研碎，精密稱取細粉9份，每份0.5 g，平均分成三組，分別精密加入上述“2.1.2”項下對照品溶液3、5、7 mL，按上述“2.1.2”項下方法處理后進樣測定，計算毛蕊花糖苷的含量，并計算回收率和RSD值。結果平均回收率為100.06%，RSD為1.51%。見表2。

2.4 樣品含量測定

取5批溫腎消腫丸樣品（批號為140409、140618、140923、141219、150228），按照“2.1.2”項下供試品溶液制備方法，分別制備成樣品溶液，并按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定。見表3。

3 討論

3.1 波長的選擇

預實驗表明，精密量取一定量的毛蕊花糖苷對照品溶液進行紫外掃描后，測得在334 nm波長下有最大吸收，故確定波長為334 nm。

3.2 流動相的選擇

《中國藥典》2015年版一部熟地黃[8]藥材飲片中毛蕊花糖苷含量測定項下，毛蕊花糖苷的流動相為乙腈-0.1%冰醋酸（16∶84）。而本研究經預實驗考察發現，該流動相條件下毛蕊花糖苷色譜峰與雜質峰分離度較差，后調整流動相為乙腈-0.8%冰醋酸（19∶81）時，毛蕊花糖苷色譜峰的分離度及保留時間均較好，故確定流動相為乙腈-0.8%冰醋酸（19∶81）。

3.3 毛蕊花糖苷提取條件的選擇

預實驗對毛蕊花糖苷的提取條件進行了考察，在提取時間（30、45、60 min）和提取溶劑用量（75倍、100倍、125倍）等條件下考察其提取得率[9]。結果發現提取時間在30 min、溶劑用量為100倍時，毛蕊花糖苷提取得率較高。

3.4 指標成分的選擇

中藥及其復方制劑所含化學成分數目眾多[10-11]，這也是發揮多方面功效的重要物質基礎，因此在質量控制中應從定性及定量等多方面進行研究，以全面控制其質量[12-15]。本研究的溫腎消腫丸為處方，由十一味中藥組成，所含成分眾多，其中車前子為方中君藥，《中國藥典》2015版一部收載的車前子藥材飲片質量標準中，對毛蕊花糖苷和京尼平甘酸進行了含量規定，而本實驗經考察發現，京尼平苷酸含量不高，故暫選擇毛蕊花糖苷作為定量指標，后期課題組將繼續研究其他成分的含量測定，以不斷提高該制劑的質量標準[16-18]。

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