丹紅合劑保護腦缺血再灌注損傷的機制研究

鄭君 陳少秀 張曉春

[摘要] 目的 研究丹紅合劑對腦缺血-再灌注損傷的保護作用機制。 方法 將48只符合改良局灶性腦缺血再灌注模型（MCAO）的SD大鼠按隨機數字表法分為MCAO組、陽性藥組（奈必洛爾）和觀察組（丹紅合劑），每組各16只，干預1周。分別在干預前后進行Longa神經學評分，測量腦梗死體積并檢測腦梗死組織中NO、一氧化氮合成酶（eNOs）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和Ca2+含量；比較干預前后大腦皮質小膠質細胞中內皮素-B（ET-B）受體及梗死區腦組織血管內皮生長因子（VEGF）蛋白及其基因表達。 結果 與干預前比較，觀察組干預后NO、eNOs、SOD、VEGF-mRNA、VEGF蛋白表達和Longa神經學評分升高，MDA、ET-B蛋白、ET-B-mRNA表達、Ca2+量及梗死體積均明顯降低，差異有統計學意義（P < 0.05）。干預后，觀察組上述指標與MCAO組比較，差異有統計學意義（P < 0.05）。觀察組VEGF-mRNA、VEGF蛋白表達、MDA和SOD水平與陽性藥組比較，差異有統計學意義（P < 0.05）。 結論 丹紅合劑對腦缺血再灌注損傷具有保護作用。

[關鍵詞] 丹紅合劑；腦缺血再灌注損傷；氧化應激；神經功能

[中圖分類號] R743 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）06（c）-0016-04

[Abstract] Objective To study the protective mechanism of Danhong Decoction on cerebral ischemia-reperfusion injury. Methods The 48 SD rats were divided into MCAO group， positive drug group （Nebivolol） and observation group （Danhong Decoction） by random number table， with 16 cases in each group， which were in accordance with the modified focal cerebral ischemia reperfusion model （MCAO）. They were intervened for one week. Before and after intervention， Longa neurological scores were taken to measure cerebral infarct volume and NO， nitric oxide synthase （eNOs）， superoxide dismutase （SOD） and malondialdehyde （MDA） in cerebral infarct tissue and Ca2+ content were detected. The endothelin-B （ET-B） receptors in cerebral cortical microglia and the expression of vascular endothelial growth factor （VEGF） protein and its gene in infarcted brain tissue were compared. Results After intervention， the levels of NO， eNOs， SOD， VEGF-mRNA， VEGF protein and Longa neurological score in the observation group were increased， while the levels of MDA， ET-B protein， ET-B mRNA， Ca2+ and infarct volume were decreased， with statistically significant differences （P < 0.05）. After intervention， the differences of those indices between the observation group and the MCAO group were statistically significant （P < 0.05）. Besides， the differences of VEGF-mRNA， VEGF protein， MDA and SOD levels between the observation group and the positive drug group were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion Danhong Decoction has a protective effect on cerebral ischemia reperfusion injury.

[Key words] Danhong Decoction； Cerebral ischemia-reperfusion injury； Oxidative stress； Neurological function

急性腦梗死具有起病急驟和致死致殘率高的特點，經溶栓干預后患者神經功能多因“腦缺血-再灌注損傷”及“氧化應激”而嚴重受損[1-2]。丹參味辛、性涼，主治心腦腹痛，紅花味辛、性溫，善通利經脈，兩者兼用具有“活血化瘀、通經祛瘀”之功率[3]。兩者復方制劑如丹紅注射液在臨床防治心腦血管系統疾病已有應用并取得了較好的臨床效果[4]。本研究用太和醫院自制的“丹紅合劑”對MCAO模型大鼠進行干預，觀察其對腦缺血再灌注后“氧化應激”對血管內皮功能及神經功能恢復的影響，現將實驗結果報道如下：

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性健康SD大鼠70只，8周齡，體質量（275±5）g，湖北醫藥學院動物中心提供，許可證號為SCXK（鄂）2017-0008。動物的使用符合3R原則，給予人道關懷，實驗前適應性飼養1周。造模后分籠飼養，大鼠自然光照，自由飲水及進食（普通飼料），動物房濕度（70～80）%，溫度（22～24）℃。

1.2 藥品與試劑

丹紅合劑由太和醫院中藥房提供（批號：THYF17 0923）；水合氯醛購自揚州市奧鑫助劑廠（批號：302-17-0）；鼠抗人一氧化氮合成酶（eNOs）和血管內皮生長因子（VEGF）檢測用ELISA試劑盒（上海酶聯生物科技有限公司，批號：S01712、S01743）；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）及NO ELISA試劑盒（上海勁馬生物科技有限公司，批號：H1094、H1103、H1067）；內皮素-B（ET-B）多克隆抗體及RT-PCR 檢測試劑盒（艾美捷科技有限公司，批號：01803、018214）。

1.3 MCAO模型制備、分組及干預

10%水合氯醛麻醉大鼠，仰臥位固定四肢和門齒，消毒后縱行切開頸正中皮膚，鈍性分離出頸內動脈及頸外動脈。結扎頸外動脈，沿頸內動脈向遠心端分離出進入顱內的翼腭動脈，然后分別用微動脈夾夾閉翼腭動脈遠心端和頸內動脈近心端，在緊靠頸內動脈近心端剪一小口，用栓線小心插入，當栓線到達翼腭動脈微動脈夾夾閉處時，松開微動脈夾，緩慢推進，當手感遇到阻力即可，栓線阻斷供血90 min后抽出以恢復大腦血流[5]。造模成功標準[6]：術后12 h以Longa神經學評分在1～4分的為造模成功。分組：剔除造模后死亡及蛛網膜下腔出血的22只，將48只造模成功的大鼠按隨機數字表法分均為MCAO組、陽性藥組和觀察組（n = 16）。干預：均采用2次/d灌胃方法給藥，共干預1周。其中MCAO組用90%NaCl灌胃對照，陽性藥組用0.05%奈必洛爾灌胃對照，觀察組用2%丹紅合劑（1 mL/鼠）灌胃。

1.4 觀察指標

采用Griess法檢測腦組織NO相對表達量；采用Western blot法檢測腦組織eNOs相對表達量；采用酶聯免疫吸附法檢測干預前后梗死區腦組織勻漿液SOD及MDA含量；免疫熒光雙標染色法檢測大腦皮質小膠質細胞中內皮素-B（ET-B）受體及梗死區腦組織VEGF的蛋白表達，實時定量（RT-PCR）檢測VEGF和ET-B受體mRNAR表達，PCR擴增引物序列用pfimer5軟件設計，檢測時先用RNA抽提試劑盒提取梗死區腦組織中總RNA并逆轉錄合成cDNA；配制PCR的總反應體系，以GAPDH為內參，PCR擴增后RT-PCR分析VEGF和ET-B受體mRNAR表達水平。其中VEGF基因上游引物：5′-ACAGGCATCGCCTACGCTAC-3′，下游引物：5′-GCATCCTCTAGCTG-ACGCACG-3′。ET-B基因上游引物：5′-CACTCCTGATGATTCCTGTACT-3′，下游引物：5′-ACTCGGTC-ACTGTCCGATC-3′。GAPDH上游引物：5′-ACTACCTGGATACCATCGACTAC-3′，下游引物：5′-CTAACCCTAGCGGATGGTC-3′。PCR反應條件：95℃預變性2 min，95、52、72℃各30 s，擴增47個循環。使用curve expert 1.3軟件繪制上述樣本標準曲線（以OD值為縱坐標、標準品的濃度為橫坐標），以目的基因灰度值/GAPDH灰度值表示VEGF mRNAR及ET-B mRNAR的表達值，讀取上述VEGF mRNAR及ET-B mRNAR濃度。比較腦梗死組織的Ca2+含量和梗死體積，并對各組干預前后進行Longa神經學評分以比較干預對神經功能的影響。

1.5 統計學方法

采用SPSS 17.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（x±s）表示，各組間先采用Levene檢驗方差齊性，當方差齊時采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；方差不齊時采用隨機設計多個樣本比較的Kruskal-Wallis H檢驗；計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 丹紅合劑對ET-B、VEGF蛋白及兩者mRNA表達的影響

MCAO組ET-B蛋白和ET-B mRNA表達干預后升高（P < 0.05）；VEGF蛋白及VEGF mRNA與干預前比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。陽性藥組ET-B蛋白和ET-B mRNA干預后明顯度降低（P < 0.05）；但VEGF蛋白及VEGF mRNA干預前后無明顯變化（P > 0.05）。觀察組ET-B蛋白和ET-B mRNA干預后有一定程度降低，且低于干預后MCAO組，差異有統計學意義（P < 0.05）；VEGF蛋白及VEGF mRNA明顯高于干預前及干預后MCAO組和陽性藥組，差異有統計學意義（P < 0.05）。見表1。

2.2 丹紅合劑對NO、eNOS、MDA和SOD的影響

與干預前比較，MCAO組NO、eNOS和SOD干預后降低，MDA明顯升高，差異有統計學意義（P < 0.05）。與干預前和干預后MCAO組比較，陽性藥組eNOs及NO顯著升高（P < 0.05），但MDA和SOD無明顯變化（P > 0.05）。與干預前比較，觀察組干預后eNOs、NO和SOD均升高，MDA降低；且eNOs和NO高于干預后MCAO組，SOD高于干預后MCAO組和陽性藥組，MDA低于MCAO組和陽性藥組，差異有統計學意義（P < 0.05）。見表2。

2.3 丹紅合劑對梗死區腦組織含Ca2+量、梗死體積和Longa神經學評分的影響

與干預前比較，陽性藥組和觀察組Ca2+量、梗死體積和Longa神經學評分均降低，且均低于干預后MCAO組，差異有統計學意義（P < 0.05）。見表3。

3 討論

生理狀態下，血管內皮細胞分泌血管活性物質NO和內皮素-1（ET-1）。ET-1屬縮血管因子，而NO屬舒血管因子，NO在eNOs的崔化作用下產生，對血管具有舒張作用[7-9]。動物實驗表明，NO在腦缺血-再灌注后釋放明顯減少，而ET-1明顯增多，調節血管舒縮平衡穩態關系因此失衡，這會導致血管內皮功能紊亂而加劇腦缺血-再灌注損傷[10-12]。ET-B受體廣泛存在于血管內皮，是ET-1的一種G蛋白偶聯受體，在缺血缺氧時可大量誘發，故ET-B蛋白及ET-B-mRNA高表達預示血管內皮損傷嚴重，而兩者表達降低則預示腦缺血現象得以改善和糾正[13-14]。除上述血管活性物質參與腦損傷外，“氧化應激”反應也是造成缺血再灌注損傷，如氧自由基、MDA等均是引起的“氧化應激”反應的重要分子機制。過度的“氧化應激”反應會增加神經細胞胞質內Ca2+濃度，減少NO生成而使血管舒張減弱。同時，Ca2+內流會消耗ATP，后者減少又會損傷內皮細胞而加重腦損傷[15]。但血管內皮損傷具有可逆性，故可應用血管和神經保護劑如應用鈣離子拮抗劑、自由基清除劑及中醫藥干預等防治和修復損傷內皮[16]。增加SOD和促血管新生因子VEGF，清除氧自由基及脂質過氧化產物MDA，抑制“氧化應激”反應，促進缺血區血管新生以增加腦血流量，這對促進神經突觸增生及缺血大腦神經重塑具有重要意義[17-18]。

在本實驗中，丹紅合劑在促進eNOs活化、刺激內皮細胞釋放NO、降低ET-B及其-mRNA表達、拮抗Ca2+內流、防止Ca2+超載等方面與β1腎上腺素受體阻滯劑奈必洛爾相似，但弱于奈必洛爾。但丹紅合劑在其他方面具有奈必洛爾所不具備的功能，如降低MDA、提高SOD的合成，這可以抑制和消除氧自由基及脂質過氧化反應對血管內皮的傷害性刺激，抑制“氧化應激”而發揮腦缺血-再灌注損傷的保護作用。另外，丹紅合劑還具有提高willis動脈環VEGF-mRNA和VEGF蛋白表達，這有利于缺血區血管新生、增加腦血流量，促進神經突觸增生及缺血大腦神經重塑，實驗中觀察到觀察組ET-B蛋白及ET-B-mRNA表達降低就足以證實腦缺血現象得以改善和糾正。觀察還發現丹紅合劑可降低梗死區腦組織含Ca2+量的作用，這一作用與其對急性心肌梗死的機制相似，可能是丹紅合劑中的丹參的主要有效成分丹參酮ⅡA發揮拮抗Ca2+內流的作用，因Ca2+內流會消耗ATP，使ATP減少，故丹參拮抗Ca2+內流可減少ATP的消耗，這可減少內皮細胞損傷，減輕腦缺血-再灌注損傷造成的腦損傷[19-20]。從實驗結果來看，丹紅合劑在改善Longa神經學評分和降低梗死體積方面與奈必洛爾相似，說明丹紅合劑具有改善腦損傷神經功能的作用。

綜上所述，丹紅合劑除具有與奈必洛爾相似的提高NO、eNOs合成、降低ET-B及其-mRNA表達、防止Ca2+超載而保護缺血區腦血管內皮細胞、促進腦神經功能恢復外，還可通過抑制氧化應激反應、提高VEGF-mRNA和VEGF蛋白表達而促進梗死區血管新生，對腦缺血再灌注損傷具有保護作用。

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