海南某規模牛場口蹄疫強制免疫效果分析

施力光 劉誠 彭維祺 胡海超 侯冠彧

摘 要 口蹄疫是我國規定強制免疫的動物疫病。為了評價口蹄疫疫苗強制免疫疫果，本研究采用液相阻斷ELISA法檢測了海南儋州某規模牛場強制免疫口蹄疫疫苗三價苗前后的免疫抗體水平。結果表明：強免口蹄疫三價滅活苗21 d后，試驗牛血清O型、A型和亞Ⅰ型抗體效價和免疫合格率均達到規定標準；O型和A型免疫效果優于亞Ⅰ型免疫效果，而且肌肉注射效果優于皮下注射效果。

關鍵詞 肉牛 ；口蹄疫 ；免疫效果 ；液相阻斷ELISA法

中圖分類號 S858.23 文獻標識碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2018.04.020

Abstract Foot-and-mouth disease （FMD） is an animal disease provided for compulsory vaccination in China. In order to evaluate the compulsory immunity effects of FMD vaccine in beef cattle， the antibody level of the beef cattle in a beef cattle farm was monitored before and after the beef cattle was inoculated compulsorily with trivalent inactivated vaccine by using the liquid phase blocking ELISA assay in Danzhou， Hainan. The results showed that the antibody level and immunity of the beef cattle against FMD virus types O， A and Asia I were consistent with the standards required after the beef cattle were inoculated for 21 days. The immune effect of the FMD virus types O and A was better than that of the type Asia1 in the beef cattle， and the intramuscular injection had better effect than the hypodermical one.

Keywords beef cattle ； foot-and-mouth disease ； immune effects ； liquid phase blocking ELISA

口蹄疫（FMD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的偶蹄動物的急性接觸性傳染病，具有發病快、時間短、范圍廣的流行病學特征[1]。我國將口蹄疫列為一類動物傳染病。迄今為止，至少有7種血清型的口蹄疫病毒已被分離鑒定，包括O、A、C、Asia1、SAT1、SAT2和SAT3型等[2]。目前預防口蹄疫病毒感染的最有效方式是通過接種疫苗，滅活的FMDV能在黏膜組織和血清中產生特異性抗體反應，并伴隨Th1/Th2反應[3]。農業部下發的口蹄疫的免疫方案明確規定，對所有牛進行O型和亞洲Ⅰ型口蹄疫的強制免疫。海南作為全國建成的首個“無規定動物疫病區示范區”，根據《海南省無規定動物疫病區管理辦法》，也對口蹄疫、高致病性禽流感、豬瘟、雞新城疫、高致病性豬藍耳病、狂犬病等6種動物疫病實施強制免疫，而且免疫密度和免疫效果應當達到國家和海南省規定的標準。為了評價口蹄疫疫苗強制免疫效果，本研究對海南儋州某規模牛場強化免疫O型、A型和亞洲Ⅰ型口蹄疫疫苗三價苗后免疫抗體消長情況進行檢測，以期為規模化牛場口蹄疫免疫提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物

于海南省儋州市境內某規模肉牛場隨機選取健康無病、體重相近的12～15月齡的海南黑牛（和牛×海南黃牛）40頭作為試驗動物，隨機分成2組，Ⅰ組和Ⅱ組，每組20頭，編號后按照常規飼養條件混群飼養。

1.1.2 強免疫苗

試驗所用疫苗購自某正規廠家生產的口蹄疫O型、A型、亞Ⅰ型三價滅活疫苗，接種途徑和免疫劑量按照疫苗說明書操作。

1.1.3 抗體檢測試劑

試驗所用O型、A型、亞Ⅰ液相阻斷ELISA試劑盒購自中國農業科學院蘭州獸醫研究所。

1.2 方法

1.2.1 強免接種

按照疫苗生產廠家推薦的接種劑量，所有試驗牛于同一時間進行強免接種，其中免疫試驗Ⅰ組于頸部皮下注射3 mL，試驗Ⅱ組于臀部肌肉注射3 mL。

1.2.2 血樣采集

試驗過程中對30頭試驗牛共采血5次，采血時間點為強免接種前（0 d）、強免后21、40、60和80 d，頸靜脈采血法用真空管采集血樣，室溫靜置15 min，待析出血清后，于4℃、2 500 r/min條件下離心15 min分離血清，用以測定抗體滴度。

1.2.3 抗體效價檢測

按照液相阻斷ELISA試劑盒操作說明提供的方法分別檢測試驗牛血清中口蹄疫A型、O型、亞洲Ⅰ型抗體效價。根據《2017年國家動物疫病監測與流行病學調查計劃》規定執行，三種口蹄疫抗體效價≥26為合格。

2 結果與分析

2.1 A型口蹄疫抗體效價

試驗牛強免O型、A型、亞Ⅰ型三價滅活疫苗后，A型口蹄疫抗體效價檢測結果如表1所示。A型抗體強免前抗體滴度為1∶101，抗體合格率95%以上，試驗牛基礎抗體水平符合國家和本省規定的免疫標準。采用肌肉注射或皮下注射強免后，A型抗體滴度顯著上升，免疫后21 d合格率為100，到40 d合格率也在95%以上；強免后60 d抗體滴度開始顯著降低，合格率也降至80%，到強免后90 d抗體已降至較低水平，見表1。

2.2 O型口蹄疫抗體效價

采用不同注射方法強免口蹄疫三價苗后O型抗體消長情況如表2所示，強免前基礎抗體滴度和合格率都在較高水平。強免后O型抗體維持時間較長，肌肉注射組試驗牛在90 d后都能保持較高的抗體滴度和合格率。皮下注射組在免疫后60 d也能保持較高的抗體效價，90 d出現明顯下降，見表2。

2.3 亞Ⅰ型口蹄疫抗體效價

強免前，試驗牛亞Ⅰ型抗體滴度較低，合格率也不到60%，強免后亞Ⅰ型抗體效價上升快，維持時間長，合格率達到90 d以上。采用肌肉注射強免后抗體滴度略低于皮下注射后的滴度峰值，但滴度降低緩慢，能維持較長時間的高抗體活性，見表3。

3 討論

按照《國家中長期動物疫病防治規劃（2012～2020年）》要求，農業部《2017年國家動物疫病監測與流行病學調查計劃》明確規定，無疫區（海南）每年開展1至2次口蹄疫監測，抗體效價≥26（1∶64）為免疫合格個體。本研究中規模牛場強免試驗前O型、A型抗體平均滴度分別為1∶123，1∶101，免疫合格率均在90%以上，達到國家和本省規定的標準，表明試驗用肉牛已實施過口蹄疫大防，且免疫效果較為理想。而亞Ⅰ型抗體效價略低于O型和A型抗體（滴度為1∶83），免疫合格率僅為58%，可能原因是與大防免疫口蹄疫疫苗有關，因為在滅活疫苗中，完整FMDV粒子（146S粒子）是至關重要的免疫抗原，它的數量和穩定性決定了疫苗的免疫效果[4-5]，亞Ⅰ型免疫特異性不強或者是未接種亞Ⅰ疫苗都可能造成抗體效價存在較大差異。

本研究強制免疫口蹄疫三價疫苗后，亞Ⅰ型抗體在免疫后21 d抗體效價顯著上升，且免疫效果持續時間長，與李旭蓉等[6]、周靜華等[7]開展的口蹄疫免疫接種效果評價結果相似。在免后90 d仍能達到70以上的免疫合格率，表明該疫苗對亞Ⅰ型口蹄疫有較好的免疫效果，也說明海南黑牛對亞Ⅰ型口蹄疫疫苗的免疫應答反應強，從而使免疫抗體保持在較高的水平。李平花等[8]通過Asia1型口蹄疫病毒受體結合位點多樣性研究證實，含RGD受體結合位點為優勢的FMDV種群，Asia1潛在的受體結合基序對FMDV的細胞識別和宿主嗜性的改變以及免疫效果提高起到關鍵作用。同樣，試驗牛對O型抗體也有較理想的免疫效果，在強免后90 d仍能保持不低于75%的免疫合格率。邵軍軍等[9]指出，可通過增加抗原表位、引入外源載體蛋白或T細胞表位等方法提高表位肽的免疫原性；楊亮等[10]通過對牛O型口蹄疫病毒Vp1蛋白上的B表位和T表位模擬結構進行驗證獲得理想的免疫效果。從強免后的試驗結果看，A型抗體較O型和亞Ⅰ型抗體滴度都要低，與賀奮義等[11]報道的結果一致。強免后40 d檢測到滴度顯著上升，但抗體效價在強免后60 d即出現了較明顯的消退，表明A型口蹄疫需要再進行二次免疫，以加強保護效果。

免疫程序和免疫方法對免疫效果有決定性的影響[12-13]。本研究中采用肌肉注射和皮下注射2種不同免疫接種方法，在強免后21 d都檢測到抗體效價達到較高水平，隨著時間的延長，采用肌肉注射接種疫苗后的抗體水平要比皮下注射后抗體水平下降緩慢，尤其是在O型和亞Ⅰ型抗體滴度消長規律中表現的更為明顯，而且肌肉注射接種的試驗牛免疫合格率高于皮下注射組，這與衛龍興等[14]在奶牛口蹄疫免疫試驗中的結果基本一致。另外，在本研究過程中，還發現皮下接種后個別試驗牛出現起包的現象，容易造成體表創傷化膿。韓惠瑛等[15]通過觀察肉牛免疫口蹄疫雙價苗抗體消長情況，證實口蹄疫疫苗一次接種免疫抗體合格率和免疫效果均低于二次、三次免疫的效果。因為特異性免疫中，機體再次受到特定抗原刺激時，記憶細胞會更迅速分裂效應T細胞和漿細胞來對抗抗原。本研究中A型口蹄疫抗體效價在強免后的60 d就出現了較大幅度衰減，如能針對性地進行一次補免或強化免疫，抗體效價和合格率將會顯著延長和提高，達到更好的免疫效果。

4 小結

綜上所述，本研究采用液相阻斷ELISA法檢測海南儋州某規模牛場強制免疫口蹄疫疫苗三價苗前后的免疫抗體水平，強免前該場肉牛O型和A型抗體水平較高，亞Ⅰ型免疫效果較差。采用不同方法統一強免后，抗體效價滴度均有明顯上升，而且肌肉注射效果優于皮下注射效果，但不同類型抗體消長規律不盡一致，針對性地在60～90 d進行一次補免或強化免疫能達到更好的免疫效果。

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