活血通痹湯塌漬療法治療兔膝骨關節炎的效果及其機制

唐芳，馬武開，周靜，盧向陽，陳琳英，蘭維婭，李宇，蔣總

(1貴陽中醫學院第二附屬醫院，貴陽550001；2貴陽中醫學院)

膝骨關節炎是由多種原因引起的以關節軟骨退變和骨質增生為主要病理變化的一種慢性疾病[1,2]。目前膝骨關節炎的病因尚不清楚，可能與軟骨細胞自我吞噬、機械力學改變、氧化應激、內部免疫、軟骨過度增生、疼痛等因素有關[3]。研究顯示，Wnt/β-catenin信號通路是參與關節軟骨細胞分化、成熟及凋亡的重要信號通路，在膝骨關節炎發生中發揮重要作用[4～6]。中藥塌漬療法具有溫經通絡、破瘀散結的功效，加上熱力作用可使藥物成分通過皮膚直接吸收，經穴滲透擴散，直達病所，從而發揮治療作用[7,8]。2016年4月～2017年10月，本研究觀察了活血通痹湯塌漬療法治療兔膝骨關節炎的臨床效果，現分析結果并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物：健康新西蘭大白兔72只，4～5月齡，體質量1.5～2.5 kg，雌雄各半，由貴陽中醫學院動物實驗中心提供。實驗藥物：活血通痹湯為貴陽中醫學院風濕免疫科以貴州苗藥為主要組成成分的臨床經驗方，藥物組成為透骨香(30 g)、透骨草(30 g)、黑骨藤(30 g)、海桐皮(50 g)、白芷(20 g)、乳香(20 g)、沒藥(20 g)、川芎(30 g)、防風(20 g)、紅花(20 g)、當歸(20 g)、大血藤(60 g)、白芍(60 g)；雙氯芬酸二乙胺乳膏(扶他林軟膏，永信藥品工業昆山股份有限公司)。主要試劑：TRIzol總RNA提取試劑購于天根生化科技(北京)有限公司，PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)、ROX plus、DL2000 DNA Marker均購于日本TaKaRa公司，組織蛋白抽提試劑盒、RIPA Lysis Buffer (Strong)、BCA蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE loading buffer、Wester blotting ladder pen均購于康為世紀生物科技有限公司。

1.2 動物分組與建模 將72只新西蘭大白兔隨機分為空白組、模型組、扶他林組、42 ℃塌漬組、37 ℃塌漬組、32 ℃塌漬組，每組12只。除空白組外，其余5組均采用關節制動法[9]建立兔右側膝骨關節炎模型，方法如下：將兔右側膝關節用管型石膏和小鋁板固定于伸直位，行右側肢體膝部管型石膏的開窗處理，限制兔關節活動，造成膝關節壓力異常，形成進行性膝骨關節炎，建模時間為4周。建模期間各組均正常飼養。

1.3 治療方法 建模第5周，扶他林組右側膝關節外用扶他林軟膏，每次約10 mg均勻外涂于右側膝關節，并輕輕揉搓至藥物完全吸收，1次/d。42 ℃塌漬組、37 ℃塌漬組、32 ℃塌漬組均采用活血通痹湯塌漬療法治療。方法如下：將活血通痹湯原藥浸泡半小時，加入適量水，放入鍋中煮沸，將藥液轉移至恒溫鍋中，42 ℃塌漬組、37 ℃塌漬組、32 ℃塌漬組分別將恒溫鍋內藥物維持溫度調整為42、37、32 ℃；各組取紗布浸泡于不同溫度藥液中，將紗布敷于患膝，每2～4 min更換一次紗布，盡量保持溫度維持不變；三組治療時間均為20 min，1次/d。

1.4 相關指標觀察

1.4.1 膝關節軟骨表面大體情況及軟骨組織病理改變 治療28天采用空氣栓塞法處死各組動物，取出右側膝關節，肉眼大體觀察軟骨表面大體情況。取部分膝關節軟骨組織，常規HE染色后光鏡下觀察軟骨組織病理改變，其余膝關節軟骨組織置于-80 ℃冰箱保存待用。

1.4.2 膝關節軟骨組織Wnt蛋白(Wnt3a、Wnt5a、Wnt7a ) mRNA表達 采用real-time PCR法檢測。取-80 ℃保存的膝關節軟骨組織約50 μg放入研缽中，充分剪碎后加入液氮反復研磨，待組織完全成粉末狀。采用TRIzol總RNA提取試劑盒提取總RNA，NanoDrop?ND-2000檢測RNA濃度和純度合格后，采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser反轉錄合成cDNA。將所有cDNA樣品配置real-time PCR反應體系，于real-time PCR儀上進行反應。Wnt3a上游引物：5′-ACGACAGCGCCTCGGAGATGG-3′，下游引物：5′-GGTTGGGCTCGCAGAAGTTGG -3′，引物長度150 bp；Wnt5a上游引物：5′-TGCCACTTGTATCAGGACCAC-3′，下游引物：5′-GCTGCCTATCTGCATCACTCT-3′，引物長度150 bp；Wnt7a上游引物：5′-CATCGGCTTCGCCAAGGTCT-3′，下游引物：5′-GCACTCCAGCTTCATGTTCTC-3′，引物長度124 bp；內參18srRNA上游引物：5′-TCTGTGATGCCCTTAGATGTCG-3′，下游引物：5′-AATGGGGTTCAACGGGTTAC-3′，引物長度104 bp。采用2-ΔΔCt法計算Wnt3a、Wnt5a、Wnt7a mRNA相對表達量。

1.4.3 膝關節軟骨組織連環素蛋白(β-catenin)、糖原合酶激酶3β(GSK-3β)蛋白表達 采用Western blotting法檢測。取-80 ℃保存的膝關節軟骨組織約50 μg，充分研磨后提取軟骨細胞蛋白。BCA定量試劑盒檢測提取的蛋白濃度，根據目的蛋白分子量大小，選擇10%的分離膠濃度。樣品加入上樣緩沖液后100 ℃加熱3 min，每孔上樣20 μL總蛋白進行SDS-PAGE，電泳后半干轉蛋白至裁剪好的電轉膜上。轉膜結束，取下PVDF膜，放入TBST中，搖床洗膜10 min/次，共2次。將PVDF膜浸泡于封閉液中，搖床封閉2 h。加入β-catenin、GSK-3β或β-actin一抗(稀釋比例分別為1∶5 000、1∶500、1∶5 000)，4 ℃孵育過夜，加入二抗(稀釋比例均為1∶200)，室溫下搖床孵育3 h。TBST充分洗滌PVDF膜3～5次，每次5 min。ECL發光試劑盒顯影、拍照，對雜交帶進行密度掃描分析。以β-actin為內參，以目的蛋白與β-actin條帶灰度值的比值計算β-catenin、GSK-3β蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 各組膝關節大體情況及病理改變比較 ①關節軟骨表面大體情況：空白組關節軟骨表面光滑，有光澤且富有彈性，未見裂痕，未見明顯腫脹、增生及滑膜充血。模型組關節軟骨表面粗糙不平整，色澤暗淡，軟骨較薄伴有糜爛，可見明顯腫脹、增生及滑膜充血。其他各組關節表面大體情況均優于模型組，但差于空白組；42 ℃塌漬組關節表面較光滑，可見輕度腫脹及滑膜充血；扶他林組及37 ℃塌漬組、32 ℃塌漬組關節軟骨表面均不平整，伴有腫脹及滑膜充血。②軟骨組織病理改變：空白組軟骨細胞數量較多，分布均勻，排列整齊，潮線完整。模型組軟骨較薄，表面粗糙，伴有列缺，細胞數目較少，排列紊亂，局部聚集明顯，染色不明顯，潮線模糊。其他各組在軟骨細胞數目、分布、染色情況及潮線等方面均優于模型組，但差于空白組；42 ℃塌漬組軟骨細胞數目較多，分布較均勻，可染色，潮線模糊但有層次；37 ℃塌漬組、扶他林組、32 ℃塌漬組軟骨細胞數量較少，分布比較亂，有局部細胞積聚，潮線較模糊。

2.2 各組膝關節軟骨組織Wnt3a、Wnt5a、Wnt7a mRNA表達比較 空白組、42 ℃塌漬組、37 ℃塌漬組、扶他林組、32 ℃塌漬組、模型組膝關節軟骨組織Wnt3a、Wnt5a、Wnt7a mRNA相對表達量均依次升高，兩兩比較P均<0.05。見表1。

表1 各組膝關節軟骨組織Wnt3a、Wnt5a、Wnt7a mRNA相對表達量比較

注：與空白組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與32 ℃塌漬組比較，cP<0.05；與37 ℃塌漬組比較，dP<0.05；與42 ℃塌漬組比較，eP<0.05。

2.3 各組膝關節軟骨組織β-catenin、GSK-3β蛋白表達比較 空白組、42 ℃塌漬組、37 ℃塌漬組、扶他林組、32 ℃塌漬組、模型組膝關節軟骨組織軟骨組織β-catenin、GSK-3β蛋白相對表達量均依次升高，兩兩比較P均<0.05。見表2。

表2 各組膝關節軟骨組織β-catenin、GSK-3β蛋白表達比較

注：與空白組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與32 ℃塌漬組比較，cP<0.05；與37 ℃塌漬組比較，dP<0.05；與42 ℃塌漬組比較，eP<0.05。

3 討論

膝骨關節炎發病機制尚不清楚，臨床缺乏有效的治療方法，只能以緩解臨床癥狀、延緩關節破壞為主[10,11]。扶他林為治療膝骨關節炎的常用藥，臨床常用其緩解疼痛。膝骨關節炎在中醫屬于“痹病”，中醫認為其病機為肝腎虧虛、筋脈失養，風寒濕之邪侵襲人體，氣血阻滯經絡，或過勞，或跌打損傷致瘀血阻絡。我國傳統中醫藥治療膝骨關節炎的方法很多，其中塌漬療法的應用已有上千年歷史，其作用原理為熱力作用有助于打開皮膚毛孔, 藥物成分可通過皮膚吸收，從而改善血液循環，發揮消腫止痛和祛風祛濕作用。活血通痹湯根據患者的病情辨證組方，具有活血化瘀、通絡止痛、強筋健骨的作用，既往有研究采用活血化瘀藥物溻漬療法治療骨關節炎臨床效果較好、不良反應較少[12,13]。本研究結果顯示，與模型組比較，扶他林組及各溫度塌漬組治療后關節組織病理改變均有所改善，但42 ℃塌漬組改善最明顯。證實活血通痹湯塌漬療法治療膝骨關節炎效果較好， 42 ℃條件下的治療效果最佳。

Wnt/β-catenin信號通路為Wnt信號通路中的經典通路[14]，該信號通路在早期胚胎發育、細胞增殖分化和凋亡、器官形成以及腫瘤形成中均發揮重要作用[15]。Wnt/β-catenin信號通路主要包括Wnt蛋白、跨膜受體(Frizzled)、散亂蛋白(Dsh)、軸蛋白(Axin)、GSK-3β、腺瘤性結腸息肉病蛋白(APC)、β-catenin及T細胞因子/淋巴增強因子(Tcf/Lef)等[16]。Wnt信號通路傳導過程中的重要組成部分是Wnt家族蛋白，其中Wnt3a、Wnt5a、Wnt7a、Wnt10a等已被證實是參與Wnt信號通路激活的上游基因[17]。β-catenin是Wnt信號通路中的關鍵成員[18]，在正常細胞中的表達水平較低。當Wnt信號通路被激活時，Wnt蛋白與細胞膜上的特異性受體蛋白結合，活化胞質內蓬亂蛋白(dishevelled、Dsh或Dvl)，抑制由β-catenin、Axin、GSK-3β、APC等組成的降解復合物合成，導致β-catenin磷酸化水平降低；β-catenin在細胞質內濃度逐漸升高，達到一定濃度后轉入細胞核內與TCF/LEF結合，激活Wnt/β-catenin信號通路下游靶基因基質金屬蛋白酶3(MMP-3)、MMP-13、骨形成蛋白2等表達，從而促進軟骨細胞增殖、分化與凋亡[19～21]。這個降解復合體中，GSK-3β發揮主要作用，GSK-3β可以促進β-catenin磷酸化，導致磷酸化的β-catenin經泛素化和蛋白酶體降解[22]。當無Wnt信號時，β-catenin與Axin、GSK-3β、APC等形成降解復合物，使β-catenin被磷酸化，無法激活下游基因表達，因此其在正常軟骨細胞中的表達水平較低。本研究結果顯示，空白組、42 ℃塌漬組、37 ℃塌漬組、扶他林組、32 ℃塌漬組、模型組膝關節軟骨組織Wnt3a、Wnt5a、Wnt7a mRNA相對表達量及β-catenin、GSK-3β蛋白相對表達量均依次升高，兩組間比較差異均有統計學意義；說明活血通痹湯溻漬療法治療兔膝骨關節炎的相關機制可能與其抑制Wnt/β-catenin信號通路傳導有關；且42 ℃條件下對軟骨細胞Wnt/β-catenin信號通路相關因子表達的抑制作用最強。活血通痹湯塌漬療法可能通過抑制Wnt/β-catenin信號通路上相關因子的表達而調控軟骨細胞增殖、分化和凋亡，從而控制膝骨關節炎的疾病進展，但是其具體的調控機制仍需進一步探討。

綜上所述，活血通痹湯塌漬療法治療兔膝骨關節炎的效果較好，42 ℃條件下的治療效果最佳；其作用機制可能與抑制Wnt/β-catenin信號通路有關。