膝骨關節炎患者軟骨組織、軟骨細胞中let-7a表達變化及意義

陳林建，李朝暉，羅真

(廣東醫科大學附屬佛山禪城中心醫院，廣東佛山528031)

骨關節炎是以關節軟骨退變為特征的老年常見疾病，以膝骨關節炎(KOA)最為常見。研究證實，關節軟骨細胞數量減少和軟骨基質降解是KOA的主要病理改變[1]，軟骨細胞凋亡和自噬在KOA的發病過程中發揮重要作用[2,3]。miRNA是一類長度為20～24 nt高度保守的小分子非編碼RNA，通過對靶基因表達的調控參與細胞增殖、分化、凋亡、自噬等一系列重要生理及病理過程[4～6]。let-7家族是最先被鑒定的miRNA之一，let-7a是該家族的成員。目前關于let-7a在KOA患者軟骨細胞中的表達及其作用機制尚不清楚。為此，我們于2016年6月～2017年6月進行了如下研究。

1 材料

膝關節軟骨組織：KOA軟骨組織取自我院行膝關節置換術的40例KOA患者(男12例、女28例，年齡64～75歲，均符合2007年中華醫學會骨科學分會制定的KOA診療指南診斷標準[7]，排除因其他疾病行膝關節置換術者)，為其膝關節軟骨外漏區邊緣的軟骨退變組織。正常膝關節軟骨組織標本取自同期因創傷于我院行下肢截肢手術的15例患者(男10例、女5例，年齡16～40歲，均為非KOA患者，既往膝關節功能正常)。膝關節軟骨細胞：取部分KOA軟骨組織及正常軟骨組織，參考文獻[8,9]的方法，用含青霉素、鏈霉素雙抗的冰冷PBS沖洗3遍，無菌眼科小剪刀剪成大小約為1 mm×1 mm×1 mm的碎塊。加入0.25 %胰蛋白酶，置于37 ℃培養箱中振蕩消化40 min，棄上清液，加入Ⅱ型膠原酶，37 ℃培養箱中振蕩消化4～6 h。3 000 r/min離心10 min，收集細胞，加入含10%胎牛血清的DMEM培養基，37 ℃、5% CO2培養箱中培養。每2～3天換液1次，細胞融合至85%左右時進行消化傳代，取傳2代細胞用于后續實驗。主要試劑：胎牛血清和DMEM培養基均購自美國Hyclone公司，TRIzol試劑購自北京雷根生物技術有限公司，Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司，M-MLV逆轉錄試劑盒購自美國Promega公司，SYBR Premix EX Taq(Perfect Real time染料法)實時熒光定量試劑盒購自日本TaKaRa公司，Annexin V-FITC細胞凋亡試劑盒購自南京凱基生物科技發展有限公司，抗微管相關蛋白1輕鏈3(LC3)抗體、抗Beclin1抗體均購自美國Santa Crus公司，抗Bax抗體、抗Bcl-2抗體均購自上海生工生物工程有限公司，HRP標記的二抗購自美國BioWorld公司。let-7a模擬物let-7a mimics及陰性對照NC-mimics均購自上海吉瑪制藥技術有限公司，let-7a及U6引物由上海吉瑪制藥技術有限公司設計合成。

2 方法與結果

2.1 軟骨組織及軟骨細胞let-7a mRNA表達檢測

2.1.1 軟骨組織let-7a mRNA表達檢測 采用實時熒光定量PCR法。分別取部分KOA軟骨組織及正常軟骨組織100 mg，充分研磨后加入TRIzol試劑提取組織總RNA，應用紫外分光光度計對每個樣本提取總RNA的A260/A280進行測定，證實符合實驗要求。按M-MLV逆轉錄試劑盒說明書將RNA反轉錄成cDNA，以cDNA為模板，參照SYBR Premix EX Taq實時熒光定量試劑盒說明書配置反應體系，應用實時熒光定量PCR儀進行檢測。let-7a上游引物：5′-GCCGCTGAGGTAGTAGGTTGTA-3′，下游引物：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。內參U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCGCAGCACA-3′，下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。PCR反應條件：94 ℃、10 s，94 ℃、5 s，60 ℃、34 s，共40個循環。采用2-ΔΔCt法計算let-7a mRNA相對表達量。結果顯示，KOA軟骨組織及正常軟骨組織let-7a mRNA相對表達量分別為0.48±0.18、1.02±0.07，二者比較P<0.01。

2.1.2 軟骨細胞let-7a mRNA表達檢測 分別取KOA軟骨細胞及正常軟骨細胞各1×107個，加入細胞裂解液進行裂解，參照2.1.1采用實時熒光定量PCR法檢測let-7a mRNA相對表達量。結果顯示，KOA軟骨細胞及正常軟骨細胞let-7a mRNA相對表達量分別為0.29±0.13、0.98±0.05，二者比較P<0.01。

2.2 let-7a過表達對KOA軟骨細胞凋亡及自噬影響的觀察

2.2.1 let-7a過表達的KOA軟骨細胞模型建立 取生長狀態良好的KOA軟骨細胞接種于6孔板，接種密度為3×105個/孔，待細胞融合60%～80%時隨機分為let-7a過表達組及對照組，分別采用Lipofectamine2000轉染let-7a mimics及NC-mimics，轉染6 h更換新鮮培養液；轉染48 h收集兩組細胞，參照2.1.1采用實時熒光定量PCR法檢測let-7a mRNA相對表達量。結果顯示，let-7a 過表達組及對照組細胞 let-7a mRNA相對表達量分別為14.84±0.58、1.01±0.06，兩組比較P<0.01。證實let-7a過表達的KOA軟骨細胞模型成功建立。

2.2.2 let-7a過表達的KOA軟骨細胞凋亡能力檢測 采用流式細胞術。收集let-7a過表達組及對照組轉染48 h后的細胞，PBS沖洗2遍，以不含EDTA的胰蛋白酶消化后，離心收集細胞制成單細胞懸液，調整細胞密度為1×106個/mL。取100 μL細胞懸液置于流式管中，加入10 μL Annexin V-FITC溶液和 5 μL碘化丙啶(PI)混勻，冰浴、暗處靜置10 min，上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。結果顯示，let-7a 過表達組及對照組細胞凋亡率分別為(5.41±1.43)%、(18.52±4.21)%，兩組比較P<0.01。

2.2.3 let-7a過表達的KOA軟骨細胞凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2及自噬相關蛋白LC3(LC3Ⅱ、LC3Ⅰ)、Beclin1表達檢測 采用Western blotting法。收集let-7a 過表達組及對照組轉染48 h的細胞，PBS沖洗3遍，加入細胞裂解液和1%蛋白酶抑制劑，冰上處理20 min。4 ℃條件下離心15 min，收集上清液，BCA法進行蛋白定量。兩組分別取30 μg蛋白上樣，經SDS-PAGE分離蛋白，轉移至PVDF 膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉。加入Bax、Bcl-2、LC3、Beclin1和GAPDH一抗(稀釋倍數均為1∶500)，4 ℃孵育過夜，洗膜；加入二抗(稀釋倍數均為1∶1 000)，37 ℃孵育1 h，洗膜。ECL染色，拍照后對蛋白條帶灰度值進行分析。以Bax、Bcl-2、LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、Beclin1與GAPDH蛋白條帶灰度值的比值計算蛋白相對表達量，并計算Bcl-2/Bax、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ。結果顯示，let-7a 過表達組Bax蛋白相對表達量低于對照組，Bcl-2蛋白相對表達量及Bcl-2/Bax均高于對照組，兩組比較P均<0.01。見表1。let-7a過表達組LC3Ⅱ、Beclin1蛋白相對表達量及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ均高于對照組，LC3Ⅰ蛋白相對表達量低于對照組(P均<0.05)。見表2。

表1 let-7a過表達組及對照組Bax、Bcl-2蛋白表達比較

注：與對照組比較，*P<0.01。

表2 let-7a過表達組及對照組LC3、BedLin蛋白表達比較

注：與對照組比較，*P<0.05。

3 討論

miRNA通過調控靶基因表達而參與細胞增殖、分化、凋亡等過程，在多種疾病的發生、發展中發揮關鍵作用[10,11]。研究發現，與正常膝關節軟骨組織相比，許多miRNA在骨關節炎患者軟骨組織中存在差異表達[12]；骨關節炎不同病情者軟骨組織中miRNA表達亦存在差異[13]，提示miRNA在骨關節炎的發生、發展過程中可能具有重要作用。let-7a屬于let-7家族的重要成員，目前已經發現其在白內障晶狀體上皮細胞、阿爾茨海默病神經細胞以及骨關節炎滑膜液等老年退行性疾病中表達異常[14～16]。本研究結果顯示，KOA軟骨組織及KOA軟骨細胞let-7a mRNA相對表達量均低于正常軟骨組織及正常軟骨細胞，提示let-7a可能與KOA的發生密切相關。

關節軟骨退變是骨關節炎發病機制的中心環節，軟骨細胞衰老凋亡是其最主要的病理表現[17]。既往研究表明，骨關節炎的一系列病理生理過程，如軟骨形成和分化、軟骨基質降解以及軟骨細胞增殖、凋亡、自噬等過程幾乎均有miRNA的參與[18]。Zhang等[19]研究發現，miR-210能夠通過靶向DR6抑制NF-κB活性抑制軟骨細胞凋亡。Huang等[20]證實，miR-337-3p能夠通過調控PTEN/AKT通路促進OA軟骨細胞增殖并抑制其凋亡。Bcl-2是Bcl-2家族中最重要的凋亡抑制因子，Bax與其功能相反，是重要的凋亡促進因子。Bcl-2/Bax是決定對細胞凋亡抑制作用強弱的關鍵因素，可反映細胞凋亡情況。本研究結果顯示，let-7a過表達組細胞凋亡率、Bax蛋白相對表達量均明顯低于對照組，Bcl-2蛋白相對表達量及Bcl-2/Bax均高于對照組；證實上調軟骨細胞let-7a表達可抑制其凋亡。

細胞自噬亦稱Ⅱ型程序性細胞死亡，是機體在生理或病理條件下的應激反應，通過溶酶體清除受損或老化的細胞器，并將其轉化為新的能量物質，從而維持機體內環境的穩定。自噬是正常軟骨細胞的保護或平衡機制，細胞自噬水平下降在骨關節炎的發生、發展中具有重要作用[21]。Caramés等[22]研究發現，骨關節炎小鼠模型中自噬相關蛋白ULK1、Beclin1和LC3表達均明顯降低。Cheng等[23]證實，軟骨細胞自噬水平下降與骨關節炎密切相關，提高細胞自噬水平可延緩骨關節炎進展，對軟骨組織具有重要的保護作用。骨關節炎軟骨細胞的自噬水平較正常軟骨細胞明顯降低，許多miRNA可通過調控軟骨細胞的自噬水平而調節骨關節炎進展[24～26]。目前研究通常以LC3Ⅱ/LC3Ⅰ評估細胞的自噬水平。Beclin-1基因是酵母菌ATG6同源體，其表達水平與自噬水平呈正相關，亦是反映細胞自噬水平的常用指標。本研究結果顯示，let-7a 過表達組LC3Ⅱ、Beclin1蛋白相對表達量及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ均高于對照組，LC3Ⅰ蛋白相對表達量低于NC-mimics組；說明上調KOA軟骨細胞let-7a表達可促進其自噬。

綜上所述，let-7a在KOA患者軟骨組織、軟骨細胞中的表達均降低；上調let-7a表達能促進軟骨細胞自噬并抑制其凋亡，從而發揮軟骨保護作用。let-7a可能成為KOA治療的一個潛在靶點。