用于大景深單分子定位顯微的多功能全息相位片的設計及數值模擬?

李四維 吳晶晶 張賽文 李恒 陳丹妮 于斌 屈軍樂

(深圳大學光電工程學院,光電子器件與系統教育部/廣東省重點實驗室,深圳 518060)(2018年3月30日收到;2018年5月16日收到修改稿)

1 引 言

在生命科學技術飛速發展的今天,為了進一步了解和研究生命體之間的相互作用、疾病的產生機理,人們迫切需要獲得更加精確的細胞內部的結構信息.但是,由于光學衍射極限的存在,常規的光學顯微鏡的分辨率只能達到200 nm左右,難以滿足現代生物醫學的需要.近年來,單分子定位超分辨熒光顯微技術的出現,如光敏定位顯微術(photoactivated localization microscopy)[1]、隨機光學重建顯微術(stochastic optical reconstruction microscopy)[2]、熒光光敏定位顯微技術( fluorescence photoactivation localization microscopy)[3]等,它們克服了衍射極限,達到20 nm的橫向分辨率和100 nm的軸向分辨率,有力地推動了生命科學的發展,廣泛應用于生物醫學的各個領域[4?8].雖然單分子定位超分辨成像系統能夠實現超分辨成像,但是較低的軸向分辨率仍有待改善.為了克服這一問題,文獻[9,10]在光路中加入柱面鏡,將單分子定位顯微的景深擴展到600 nm;Pavani和Piestun[11]在探測光路中引入特殊相位,將點擴散函數變為雙螺旋的形式,實現熒光分子在軸向±2μm范圍內的三維定位;Juette等[12]將探測光路分光并引入光程差,通過計算兩路光的光程差來獲得熒光分子的軸向位置,使成像景深達到1μm.雖然這些方法顯著地提升了單分子定位超分辨成像系統的成像景深,但對于厚度約10μm的完整細胞而言,現有的方法還不能滿足多分子追蹤時的大景深要求.為了獲取整個細胞的信息,傳統方法是對同一細胞的不同軸向位置的層面進行一系列掃描探測,再由相關算法將所有層面信息按照軸向位置排序合成,還原出整個細胞內的分子信息.但是,在三維掃描的過程中,不同層面的信息會相互影響,產生背景噪聲和熒光漂白,降低分辨率.一些研究者提出使用變形光柵對樣品進行多層面探測[13?15],但由于變形光柵的能量主要分布在衍射的0級與±1級,故該方法最多只能對細胞內九個不同層面同時成像,因此,在實現大的軸向探測范圍的同時無法保持較高的軸向分辨率.Yu等[16]提出一種達曼變形光柵(distorted dammann grating,DDG),它通過達曼編碼的方式將大部分的光強均勻分布在需要的幾個衍射級上,有效地提高了傳統變形光柵的高衍射級效率.但是,達曼編碼的方式對單個周期中相位分布的寬度有著嚴格的要求,無法適用于空間光調制器(spatial light modulators,SLM).針對這一問題,Zhu等[17]提出了一種能夠適用于SLM的多值純相位光柵(multi-value pure-phase grating,MVPPG)編碼方法.在一個周期中,它由多個相位值構成,每個相位分布具有相同的寬度,通過選取合適的相位值,可以獲得與達曼編碼一樣的效果.在此基礎上,我們將MVPPG和DDG的設計思路相結合,提出一種變形多值純相位光柵(distorted multi-value pure-phase grating,DMVPPG),它不僅具有與DDG相同的特性,并且解決了其無法適用于SLM的缺陷,減少了光柵加工的成本與時間,降低了使用的難度.另外,通過波前編碼技術將雙螺旋相位引入DMVPPG中,獲得具有復合功能的全息相位片.這種新型的全息相位片可以將細胞樣品中不同層面的分子信息以雙螺旋點擴散函數(double-helix point spread function,DH-PSF)[18]的形式成像在同一像平面的不同位置,并且相互之間的光強相近.經過理論以及數值模擬證明,在納米分辨多分子追蹤系統中,相比于變形光柵,這種新型全息相位片可以獲得更高的清晰度和更多細胞層的信息,有效地提高單分子定位顯微鏡的成像深度.

2 原理和方法

2.1 雙螺旋點擴散函數

DH-PSF是一種特殊的點擴散函數,在其傳播橫截面上,光強分布呈現為兩個相對的旁瓣,隨著物體在軸向離焦距離的變化,原本水平方向上的兩個旁瓣會發生旋轉和縮放,如圖1所示.而且旋轉的角度與離焦距離成正比關系,如圖2所示.基于這一特性,DH-PSF可以用來對三維空間中的稀疏粒子進行橫向和軸向的高精度定位[19,20].傳統方法獲得DH-PSF的過程較為復雜,需要尋找位于拉蓋爾高斯(Laguerre-Gauss,LG)模式平面上特定直線上的LG模式,將這些模式進行線性疊加得到DH-PSF[21],并對其相位分布進行迭代優化[22],來獲得高效率的相位模板.本文中使用一種簡單方法[23]設計DH-PSF.,基于渦旋的傳播性質和螺旋光的基礎理論[24],把DH-PSF解析為光瞳平面沿直徑方向上的渦旋光的疊加,其數學表達式如下:

式中i2=?1;(x,y)為相位片的光瞳坐標;(xk,yk)為第k個螺旋光的相位奇點的坐標;Rdh為光瞳半徑;Ndh為螺旋光的數目,當Ndh增加時,光強更加集中在兩個旁瓣上;M為(Ndh?1)/2;d為相鄰的渦旋奇點的距離,當d增大時,兩個旁瓣的相對距離會隨之增大.相比于傳統方法,該方法大幅降低了DH-PSF相位片的設計難度,并且具有更高的定位精度和效率.

圖1 DH-PSF相位片和DH-PSF在不同軸向位置的光強分布Fig.1.DH-PSF phase mask and DH-PSF at different axial planes.

圖2 DH-PSF兩個旁瓣旋轉角度與z軸位置的關系曲線Fig.2.The relationship between the two lobes rotation angles of DH-PSF and the position of z axis.

2.2 變形多值純相位光柵

DMVPPG是通過多值相位編碼技術,對傳統變形光柵[25]進行相位編碼.一方面,DMVPPG與傳統的變形光柵一樣,具備菲涅耳波帶片的透鏡作用,在不同衍射級具有不同焦距的透鏡效應;另一方面,對于傳統的變形光柵,入射光能主要分布在低衍射級上,高衍射級上的信號難以被探測,而DMVPPG在需要的幾個衍射級上的光強分布趨于一致,從而能夠探測到更高衍射級的信息.本文設計的DMVPPG具有純相位結構,相比振幅光柵,其效率大大提高.其透過率函數可表達為

式中(x,y)為DMVPPG為入瞳面的坐標;Λ為x方向上光瞳孔徑中心的光柵周期;

R為DMVPPG的光瞳半徑,n0是聚焦區域的折射率,K是常數,決定變形光柵不同衍射級的焦距大小,當光柵緊貼透鏡時,K為聚焦透鏡的數值孔徑,W20為光柵的離焦系數.m為衍射級,其對應的衍射系數Cm表示如下:

式中,N是一個周期內被劃分的塊數;φn是第n塊的相位分布值它的選取直接決定了衍射級之間光強分布.因此,通過最優化算法[26],可以尋找合適的相位值來使得所需要的β個衍射級的光強分布相當,即|Cm|2=|C0|2.在實際光柵相位生成中,根據(3)式計算得到φn,并生成一個二值相位光柵,在一個歸一化的周期內,其光柵條紋的每個離散的相位所占寬度為1/N.并引入(1)式中相同的離焦相位ψw,其透過率表達式如下:

M0為傅里葉級數截斷級,其m級的衍射系數Am為

取Tgrating(x,y)的實數部分,并將數值大于0的部分賦值為1,數值小于0的部分賦值為?1,這樣可以得到一個黑白相間的光柵相位分布.最后,將φn的值依序賦值到黑和白的相位區域內,將原本的二值相位轉換為多值相位的形式,如圖3所示.

圖3 變形多值純相位光柵的設計方法Fig.3.The design method of DMVPPG.

圖4 多值純相位光柵的相位分布和切面的結構 (a)多值純相位光柵的相位分布;(b)多值純相位光柵在切面上的結構Fig.4.Phase distributions of MVPPG and structure in the section:(a)Phase distributions of MVPPG;(b)the structure of MVPPG in the section.

圖5 變形多值純相位光柵的相位分布及其成像原理 (a)一維變形多值純相位光柵的相位分布;(b)一維變形多值純相位光柵成像原理;(c)二維變形多值純相位光柵;(d)二維變形多值純相位光柵成像原理Fig.5.Phase distributions and imaging principle of DMVPPG:(a)The phase distribution of 1×5 DMVPPG;(b)the imaging principle of 1D-DMVPPG;(c)the phase distribution of 5×5 DMVPPG;(d)the imaging principle of 2D-DMVPPG.

當DMVPPG透過率函數中離焦系數W20=0時,光柵退化為MVPPG.在一個歸一化周期內,光柵被等分為N個部分,每個部分具有不同的相位值φn,如圖4(a)所示,其切面結構原理圖如圖4(b)所示;當W20/=0,MVPPG中加入了離焦相位ψw,其相位分布如圖5(a)所示.相位條紋產生彎曲,在不同衍射級上引入了不同焦距的透鏡效應,其m衍射級對應的焦距這一特性使得樣品內不同軸向位置的信息(相鄰的兩個樣品面的間隔為Δz)從左到右的成像在同一平面,其原理如圖5(b)所示.如果需要獲得更多樣品層的信息,可以簡單地將一個1×Mx的DMVPPG和一個1×My的DMVPPG正交重疊,生成一個Mx×My階的二維DMVPPG,為了保持兩個相鄰樣品面之間的距離相等,其離焦系數W20,x/W20,y應等于Mx或者1/My,其相位如圖5(c)所示.當樣品面位于軸上不同位置時,經3×3的DMVPPG和透鏡成像在探測面,其成像位置與物方樣品位置之間的關系如圖5(d)所示.當樣品面與系統的物方焦平面重合時,即Z=0,其成像位于探測面的正中心;當樣品面距離系統的物方焦面的距離為?4Δz時,其成像在探測面的左上角.因此,DMVPPG可以不依靠軸向掃描來實現軸向大范圍的高分辨率三維成像,可以廣泛地應用到活細胞三維顯微成像、納米尺度三維單分子定位及成像等領域.

3 新型全息相位片

新型全息相位片是通過波前編碼技術,將DMVPPG與DH-PSF結合產生的,其相位分布為

它是由雙螺旋相位片的相位φdh與變形多值純相位光柵的相位φdmvppg線性疊加而成,這種全息相位片可以將不同樣品面的分子信息以雙螺旋點擴散函數的形式成像在同一探測面上不同位置,并且它們之間的光強趨于一致.將其放入顯微成像系統中,其工作光路如圖6所示.反射式的SLM位于4f系統的傅里葉面位置,實驗中,全息相位片顯示在SLM的液晶面板上,通過相機一次曝光,可以實現對細胞內不同深度的分子信息并行成像;根據光柵參數的不同,可以對光學系統的景深進行不同倍率的擴展;同時,它兼具雙螺旋點擴散函數的性質,可以對景深范圍內的離散的分子進行納米精度的三維定位.因此,新型的全息相位片可以將原有的探測深度延展數倍,有利于對完整細胞中的分子結構進行三維探測,減少多次探測所帶來的誤差,提高了單分子定位的定位精度.

圖6 基于全息相位片的大景深三維熒光顯微成像系統Fig.6.Large depth of field 3D fluorescence microscopy imaging system based on a new type holographic phase mask.

4 數值模擬與結果分析

圖7 二維變形多值純光柵、雙螺旋相位片以及全息相位片的相位分布 (a)二維變形多值純光柵的相位分布;(b)雙螺旋相位片的相位分布;(c)全息相位片的相位分布Fig.7.Phase distributions of 2D-DMVPPG,DH-PSF phase mask and the new tape holographic phase mask:(a)The phase distribution of 2D-DMVPPG;(b)the phase distribution of DH-PSF phase mask;(c)the phase distribution of the new tape holographic phase mask.

為了證明這種新型全息相位片可以有效提高單分子定位顯微系統的探測景深,根據圖6中的光路進行數值模擬.首先,設計生成5×5的DMVPPG,如圖7(a)所示,像素數為600×600,像素尺寸為10μm;單個周期的劃分塊數N=4,對應的相位值φn分別為1.1165π,0.7761π,1.8472π和0.7761π;K=0.4841;周期Λ=200μm;x,y方向的離焦系數分別為W20,x=10λ,W20,y=50λ.接著根據(1)式生成雙螺旋相位,其像素數和像素尺寸與DMVPPG相同,如圖7(b)所示,其中Ndh=9,d=0.7Rdh,旋轉180°對應的軸向范圍為1.125μm.最后根據波前編碼技術將兩者相位結合,生成新的全息相位片,如圖7(c).將全息模版放置在焦距f=20 cm的4f系統中,在入射波長λ=480 nm條件下根據系統參數,可以計算出相鄰衍射級對應樣品面之間的距離Δz=0.5μm,匹配雙螺旋最佳定位精度的旋轉范圍為?40°—40°.

在物方軸上的不同位置,依次模擬點光源來作為細胞中的分子,兩個相鄰的點光源距離為0.5μm,經4f系統后成像在CCD的探測面上,根據光源的不同的軸向位置,在焦平面的對應區域形成雙螺旋點擴散函數,如圖8所示,其中虛線區域為對應雙螺旋點擴散函數的放大圖.當點光源位于4f系統透鏡的前焦點處,探測面上形成清晰的雙螺旋點,位于整個視場中心,如圖8(a)所示,雙螺旋的兩個旁瓣保持水平.當點光源與前焦點的距離為0.5Δz時,其恰好位于物方相鄰兩個成像層面的中間位置,因此衍射零級和衍射+1級上會同時出現光強相等的雙螺旋點,它們分別順時針旋轉40°和逆時針旋轉40°.如圖8(b)所示.當光源距離焦點距離?12Δz時,雙螺旋點分別出現在視場的左上角,如圖8(c)所示.通過上面的模擬結果,可以證明設計出的全息相位片能夠達到理論上的最大擴展深度,有效地將系統探測范圍提升到±6μm.相比于傳統的多焦面超分辨單分子定位熒光顯微系統,大幅提高了樣品的成像層數,將樣品內相鄰的兩個探測面的間隔縮小到0.5μm,提高了軸向的分辨率.最后,將每個衍射級的強度進行統計,并進行歸一化計算,如圖9所示.可以看出多值相位編碼有效地將光強均勻分布到所需要的25個衍射級上,提高了高衍射級的光強分布.雖然衍射級之間的光強并沒有達到理論上的一致,經分析可能是由于相位片在構成像素數較少的情況下,隨著離焦因子的增大,DMVPPG的像素化的相位分布會與理論值存在一定誤差,光強在不同衍射級上的分布會受到影響,因而,隨著構成光柵的像素數增加,像素尺寸減少,并選擇合適的離焦因子,光柵的均勻性會隨之改善.模擬結果表明這種新型全息相位片可以實現對細胞的多層面上的分子同時成像,并將系統的普通點擴散函數轉換為雙螺旋的形式,通過雙高斯擬合定位算法,可以實現精度在10 nm的單分子定位,提高了相鄰細胞面之間離焦的分子的定位精度.如將上述全息相位模板應用到單分子定位超分辨熒光顯微中,結合熒光分子的稀疏激發,可以同時對整個細胞內多個分子進行實時追蹤和定位.

圖8 點光源處于不同軸向位置的成像結果 (a)新型全息相位片的相位分布;(b)點光源位于z=0.5Δz位置的成像結果;(c)點光源位于z=?12Δz位置的成像結果Fig.8.Imaging results of point light sources at different axial positions:(a)The image result as the point source in the z=0;(b)the image result as the point source in the z=0.5Δz;(c)the image result as the pointsource in the z= ?12Δz.

圖9 探測面上不同衍射級光強分布Fig.9.The intensity distribution of different diffraction orders in the detection plane.

5 總 結

本文設計的新型全息相位片在擴展了探測景深的同時有效地提高了軸向的分辨率,并且將普通的點擴散函數轉換為雙螺旋的形式,提高了單分子定位的三維定位精度.將這種新型全息相位片通過SLM顯示應用到單分子定位顯微鏡中,可以實現對整個細胞中多個分子的追蹤和高精度定位.一方面,多值相位編碼可以使得所需求的衍射級上的能量分布趨于一致,進一步提高了衍射效率,彌補了傳統變形光柵高衍射級的信號光太弱而無法探測的問題;另一方面,它可以有效地通過SLM來實現,省去了光柵加工的成本與時間.模擬結果表明:這種方法能夠將原本的單分子定位顯微鏡成像深度擴大數倍,并且能量利用率高,擴展了單分子定位顯微的景深;同時,為完整細胞內多個生物分子實時變化的觀察和追蹤提供一個更好的方案,對研究生物學中的分子機制有著重要的意義.