熒光壽命顯微成像技術及應用的最新研究進展?

劉雄波 林丹櫻 吳茜茜 嚴偉 羅騰 楊志剛 屈軍樂

(深圳大學光電工程學院,光電子器件與系統教育部/廣東省重點實驗室,深圳 518060)(2018年2月10日收到;2018年6月4日收到修改稿)

1 引 言

熒光顯微成像技術可借助熒光標記來實現對樣品的特異性成像,被廣泛應用于生物醫學研究等領域[1,2].熒光具有多個特征參量,包括光譜、強度、壽命、偏振等,都可用于產生圖像對比度,其中通過測量熒光壽命形成圖像的技術稱為熒光壽命顯微成像( fluorescence lifetime imaging microscopy,FLIM).FLIM技術不受激發光強度、探針濃度、光漂白等因素的影響[3,4],且能區分熒光光譜非常接近的不同熒光團[5?7],因此具有非常好的特異性和很高的靈敏度.此外,由于熒光分子的熒光壽命能十分靈敏地反映激發態分子與周圍微環境的相互作用及能量轉移,FLIM技術常被用來實現對微環境中許多生化參量的定量測量,如細胞中折射率、黏度、溫度、pH值的分布和動力學變化等[4,6,7],這在生物醫學研究中具有非常重要的意義.近年來,隨著激光技術、探測器技術、超分辨成像等相關技術的快速發展[3,7],同時結合算法和熒光探針合成技術的進步,FLIM不僅在技術上得到了快速發展,而且被廣泛地應用于生物醫學和納米材料等研究領域.本文介紹基于不同熒光壽命探測方法的FLIM成像技術的基本原理及特點,并在此基礎上概述該技術及其應用的最新研究進展,最后對其發展前景進行展望.

2 FLIM的分類及其特點

如圖1(a)所示,熒光分子受到激發光激發后,其電子吸收激發光光子能量由基態躍遷至激發態,隨后經短暫的振動弛豫及內轉換過程后回到基態并發出熒光光子.激發光撤銷后,由于每個熒光分子處于激發態的時間長短不一,熒光物質作為一個整體,其熒光強度I呈指數衰減,當熒光強度衰減為初始強度I0的1/e時所用的時間稱為熒光壽命τ(同時存在多個壽命組分時用τi表示,如圖1(a)公式所示,其中ai表示各組分的占比),用于表征熒光分子在激發態的平均停留時間,與其由激發態返回基態的退激速率成反比,是熒光分子固有的一個特征參數,和絕對發光強度無關.由于熒光分子的退激過程很容易受到周圍微環境變化的影響,因此通過測量熒光壽命能十分靈敏地對周圍的微環境變化進行監測.FLIM技術根據壽命獲取方式的不同分為頻域法和時域法兩類:頻域法利用經過調制的連續光激發樣品,通過檢測熒光信號的振幅和相位變化來計算壽命;時域法采用高重復頻率的超短脈沖激光激發樣品,通過分析脈沖過后的熒光衰減曲線得到壽命信息.在時域法中,由于目前探測器的響應尚不能直接記錄熒光衰減曲線,因此需要采取一些巧妙的間接探測方式,常用的有門控法、條紋相機法、時間相關單光子計數(time-correlated single photon counting,TCSPC)法等[8,9],如圖1(b)—(e)所示.

圖1 熒光壽命基本原理及其測量方法示意圖[8,9] (a)熒光發射及熒光強度衰減曲線示意圖(單組分、多組分);(b)頻域法;(c)門控法(單組分);(d)條紋相機法;(e)TCSPC法Fig.1.Basic principle of fluorescence lifetime and schematic diagrams of lifetime measurement methods[8,9]:(a)Schematic diagrams of fluorescence emission and fluorescence intensity decay curves(single component and multicomponent);(b)frequency domain method;(c)gated image method(single component);(d)streak camera method;(e)TCSPC method.

2.1 頻域法

頻域法測量熒光壽命最早是由日本大阪大學提出的[10],其基本原理是采用強度按正弦調制的激發光激發樣品,產生的熒光信號頻率與激發光相同,但幅值下降、相位滯后,如圖1(b)所示,可通過兩者的振幅比(M=(b/B)/(a/A))和相位差(Δ?)計算樣品的熒光壽命(τΔ?=(1/ω)tanΔ?,τM=(1/ω)[1/(M2?1)]1/2,ω為調制頻率)[4].對于單組分,有τΔ?=τM[6,7].頻域法的優點是原理簡單,對設備要求不高,相比時域法成本低.但由于熒光壽命一般與調制頻率成反比,測量不同熒光壽命的樣品需要選擇不同的調制頻率,因此通常需要采用調制頻率連續可調的激光源.另一方面,頻域法理論上可以分辨多組分樣品的熒光壽命,但實際操作時通常需要預先采用熒光壽命已知的樣品對系統進行標定,才能確保測量的準確性,同時還要預估樣品中熒光組分的數量,再對各組分逐一進行測量,因此測量過程較為復雜繁瑣,成像速度受到限制.相比采用掃描成像方式的頻域FLIM,寬場頻域FLIM成像速度相對較快,但離焦背景熒光和散射光的影響使得圖像對比度較差,成像深度受限[11].

2.2 門控法

時域法采用脈沖激光激發樣品,相比頻域法的高強度連續激光照射,對樣品的光損傷更小.當樣品的熒光強度呈單指數衰減時,可采用門控法測量其熒光壽命.如圖1(c)所示,門控法的基本原理是采用具有時間分辨能力的探測器記錄不同“時間門”處的光強來計算或擬合壽命.常用的探測器為像增強型電荷耦合器件(intensi fied charge-coupled device).由于門控法采用寬場成像方式,且對于單組分熒光壽命的測量理論上僅需探測兩個不同時刻的熒光強度[12],因而門控法FLIM在各種方法中成像速度是最快的.但門控法對系統同步及探測器的靈敏度要求非常高,且通常在單次時間門內光子利用率較低,采集的熒光信號較弱,同時寬場成像方式由于成像對比度較差,得到的熒光壽命值精度不高[8].此外,在獲取多組分熒光壽命時,門控法需要多個時間門,且分析較為復雜,因此應用相對較少.

2.3 條紋相機法

如圖1(d)所示,條紋相機法的基本原理是利用條紋相機(streak camera,也稱掃描相機)中掃描電場的加速使不同時間到達的光電子在空間上分開,從而將時間分布轉化為空間分布以獲取熒光衰減信息[13].由于相機的一個空間維度被用于顯示時間分布,因此激發樣品時一般需要利用柱透鏡或振鏡的一維掃描對樣品進行線照明,再通過垂直方向的掃描實現二維成像.這種方法的時間分辨率較高,但動態范圍通常較窄,且由于成像時需要至少一維掃描,又受到條紋相機積分時間及讀出速度等參數的限制,因而成像速度較慢[5,9].

2.4 TCSPC法

TCSPC法是目前測量熒光壽命時間分辨率最高、應用最廣泛的技術.如圖1(e)所示,TCSPC法的基本原理是記錄激發脈沖過后首個熒光光子到達探測器的時間并進行計數,多次重復建立一個正比于熒光衰減曲線的光子數-時間分布直方圖,用于擬合熒光壽命.由于需要探測單光子信號,TCSPC-FLIM一般采用高靈敏度光電倍增管(photomultiplier tube,PMT)或雪崩光電二極管(avalanche photodiode,APD)作為探測器,因此通常建立在激光掃描共聚焦顯微鏡(laser scanning confocal microscope,LSCM)或雙光子激發熒光顯微鏡(two-photon excitation fluorescence microscope,TPEFM)上,通過逐點掃描來成像.基于統計分析的TCSPC法避免了熒光強度的直接測量,因而信噪比高,探測效率近乎理想.但為了獲取準確的計數,每個激發周期內產生熒光光子的概率要很低(一般為1%左右),而每個像素點擬合出一條信噪比較好的衰減曲線至少需要上千光子數,這就導致成像速度通常較慢.此外,由于TCSPC技術測量熒光壽命的精度很高,因此對硬件設備要求也較高,如需要能輸出超短脈沖的飛秒激光器,高探測效率、響應性能非常好的探測器等.

3 FLIM成像性能的提升

近年來隨著激光器、探測器等相關技術的快速發展,FLIM技術在成像性能方面的大幅度提升成為該領域的研究熱點.針對前面提到的不同熒光壽命探測方法的優缺點,成像性能的提升主要體現在FLIM成像速度、熒光壽命測量精度、以及成像質量和空間分辨率三個方面的提升,以下分別進行闡述.

3.1 FLIM成像速度的提升

成像速度的提升可以說是各種熒光顯微成像技術應用于活細胞成像時的共同追求.如前所述,除門控法外,其他FLIM技術基本上都存在成像速度較慢的問題.例如,目前應用最廣泛的TCSPCFLIM由于需要掃描,而且通常需要多次重復掃描來為每個像素采集足夠多的光子用于擬合熒光壽命,因此成像速度較慢,一定程度上限制了其在活細胞內分子間相互作用、信號傳導等瞬態過程研究中的應用.通過改善硬件性能可一定程度上提升TCSPC-FLIM的成像速度,如Orthaus-Mueller等[14]采用超短死區時間的TCSPC模塊和混合型PMT的組合提高了單個激發周期的探測效率,實現了成像速度的提升,從而在對水溶液中擴散的熒光珠進行成像時獲得了3幀/s的成像速度(圖像大小為128 pixel×128 pixel,如圖2(a)所示).

圖2 FLIM成像速度的提升 (a)采用超短死時間TCSPC硬件實現水溶液中擴散熒光珠的動態FLIM成像(128 pixel×128 pixel,3幀/s)[14];(b)采用多焦點多光子激發SPAD陣列技術獲取活細胞內蛋白質相互作用的FLIM圖像(256 pixel×256 pixel,15 s/幀)[21]Fig.2.Improvement in FLIM imaging speed:(a)Dynamic FLIM imaging of diffuse fluorescent beads in aqueous solution(128 pixel×128 pixel,3 fps)with ultra-short dead time TCSPC hardware[14];(b)FLIM images of live intracellular protein interactions using multi-focus multiphoton excitation SPAD array technology(256 pixel×256 pixel,15 s/frame)[21].

相比掃描方式,寬場成像可顯著提升成像速度,而近幾年快速發展起來的單光子雪崩二極管(single photon avalanche diode,SPAD)陣列與TCSPC的結合為實現寬場TCSPC-FLIM提供了可能[15,16].SPAD增益高、響應速度快,具有單光子探測能力,且可基于標準互補金屬氧化物半導體工藝生產,既能實現陣列集成,又能方便地將TCSPC電路整合到每個像元中,從而實現寬場TCSPC-FLIM成像.哥倫比亞大學Shepard等[17]集成了64×64個SPAD及時間-數字轉換器(time-to-digital converter,TDC)模塊,理論分析與模擬表明采用該探測器可使FLIM成像速度達到100幀/s.不過目前由于SPAD陣列傳感器的像元尺寸過大,填充率偏低[18,19],用于寬場TCSPCFLIM時還存在分辨率不高等問題,因此尚處于初始發展階段.而且隨著SPAD陣列傳感器像素數目的增加,寬場TCSPC-FLIM需要讀取的數據量會急劇增大,這對計算機運行速度也提出了挑戰.針對這一問題,天津大學Xu等[20]提出基于事件驅動讀出的SPAD傳感器技術,通過僅讀出有效的時間與位置信息減小數據量來提升成像速度.Poland等[21]則結合SPAD陣列和多焦點多光子激發TCSPC-FLIM技術,既獲得了與LSCM-FLIM相當的空間分辨率,又進一步提升了成像速度,實現了對活細胞中蛋白質相互作用過程的FLIM成像(如圖2(b)所示).

除了將掃描變成寬場成像,對掃描方式加以改進也是提升成像速度的一種有效途徑.傳統的掃描一般采用振鏡,掃描方式為柵掃描.深圳大學屈軍樂課題組搭建的基于條紋相機的雙光子激發FLIM系統中采用高速振鏡掃描實現了二維FLIM成像,獲得了50 ps左右的時間分辨率,并使圖像獲取時間顯著縮短[22].而對于大多數生物樣品而言,視場中往往只有部分感興趣區域.假如掃描時可跳過感興趣區域以外的像素,直接針對視野中的若干感興趣區域掃描,則可節省大量時間,提升成像速度.該課題組根據這一思路發展了一種基于聲光偏轉器(acousto-optic de flector,AOD)尋址掃描的AOD-FLIM技術[23],通過減少有效掃描面積縮短采集時間,從而達到大幅提升成像速度的目的.結合單粒子定位和反饋控制,他們還進一步發展了可用于運動粒子FLIM成像和追蹤的單粒子定位FLIM技術[24],在活細胞內運動目標的熒光壽命探測方面具有一定的應用前景.

通過擬合算法的改進來降低熒光衰減曲線擬合對光子數的要求也是提升時域FLIM成像速度的一種思路.傳統的熒光衰減曲線擬合通常采用最小二乘法(least-squares,LS),該算法原理簡單,但要求獲取足夠多的光子數用于曲線擬合,延長采集時間可增加光子數,但是降低了成像速度.采用極大似然估計(maximum likelihood estimate,MLE)算法擬合數據可一定程度上降低對光子數的要求,進而可一定程度地提升成像速度[25,26].近幾年提出的相量分析法則無需擬合壽命曲線,而是通過將各像素點的熒光衰減信息直接變換到相量圖(phasor plot)上對應的點來獲取壽命信息.該方法不僅簡化了數據分析,而且可以方便地實現單組分與多組分指數分布的區分,但目前測量精度還有待提升[5,11,27,28].Lakner等[29]在研究直腸癌3D細胞模型時對比分析了相量分析法及傳統的多指數擬合方法,結果表明前者在量化分析時需要較少的初始假設,更加簡便快速.Marois等[30]提出基于泊松統計的降噪主成因分析(noise-corrected principal component analysis,NCPCA)算法,用于校正時域FLIM數據存在的誤差噪聲,該方法可以更低的光子計數來檢測微環境的分布,速度快,在確定組分數量時所需光子數比相量分析法還要少,且不需要事先知道組分數量或熒光分子的衰減動力學常數.

3.2 熒光壽命測量精度的提升

在保證快速FLIM成像的基礎上,如何實現熒光壽命的準確測量也是關鍵問題.其中熒光壽命測量精度可從硬件與軟件兩方面進行改善.近年來,隨著超快激光器、高靈敏度探測器的快速發展,硬件性能及光路質量得到了大幅提升,系統噪聲可以更低,信號采集效率可以更高,圖像信噪比提高,因此熒光壽命測量精度也有所提升.但是通過硬件提升壽命測量精度的效果始終有限,且成本較高[31].因而許多科研人員轉而通過算法來加以改進,即解決在較低信噪比或較少光子數前提下如何保證壽命計算精度的問題.最簡單的做法是運用圖像處理算法對獲得的信噪比較差的熒光壽命圖像先進行預處理,如天津理工大學的邵永鑫[32]先采用小波變換算法去噪,再結合遺傳算法(genetic algorithm,GA)、反向傳播(back propagation,BP)算法進行小波神經網絡學習,從而提高熒光壽命測量的準確性.中國科學院大學劉超[33]同時對雙門控探測的快速壽命算法(rapid lifetime determination,RLD)及多門控探測的LS擬合算法進行了對比研究,結果表明前者成像速度快但測量精度差,后者則恰好相反,兩者在生物醫學應用中可適用于不同場合.此外他們還對基于列文伯格-馬克夸特(Levenberg-Marquardt,L-M)的高精度熒光壽命算法展開了研究,發現該算法比RLD和普通的LS具有更好的擬合精度,且能適用不同的儀器響應函數(instrument response function,IRF)模型[34].

針對TCSPC-FLIM,前面提到的MLE算法擬合可以降低對擬合光子數的要求,在提升成像速度的同時保證了測量精度[25,26].華中科技大學曾紹群課題組[31]對一階矩(the first moment,M1)法與傳統的LS進行了比較,結果發現在壽命較短且光子數較少的情況下,M1法更具優勢.牛津大學Rowley等[35]提出采用貝葉斯方法(Bayesian analysis,BA)來分析指數衰減數據,并以較高的精度對TCSPC系統進行建模,再對單指數與雙指數模型進行數據分析,相比上述的LS與MLE算法,其準確度提升了兩倍.韓國Yang等[36]還將壓縮感知(compressed sensing,CS)算法用于熒光壽命數據分析,提高了對稀疏分布的多組分熒光壽命值估計的準確性.這幾種適合低光子數情形的熒光壽命擬合算法的簡單比較如表1所列.

改善解卷積算法也可以一定程度上提升壽命測量精度.如Zhang和Li[37]通過理論分析和模擬對最小方差拉蓋爾算法(least-squares deconvolution with Laguerre expansion,LSD-LE)進行了修正,提出在評估解卷積的性能時應考慮泊松噪聲而非高斯噪聲.西安理工大學華燈鑫等[38]采用改進的向前迭代解卷積算法反演出葉綠素的熒光壽命,獲得了比傳統迭代解卷積算法更高的精度.但這些解卷積算法一般需要先確定準確的IRF,因此這又涉及到IRF的精確測量.華東師范大學潘海峰等[39]以飽和碘化鈉溶液猝滅后的熒光素作為樣品,發展了一種精確測量TCSPC系統IRF的方法,從而提高熒光壽命測量的準確性.Gao和Li[40]則采用擴展卡曼濾波(extended Kalman filter,EKF)算法,同時估計出TCSPC-FLIM系統測量的熒光壽命和IRF,避免了對IRF的直接測量,同時該方法還具有對測量時間窗不敏感、測量動態范圍大的優勢.

表1 低光子數情形下幾種熒光壽命擬合算法的比較[25,26,31,35,36]Table 1.Comparison of several fluorescence lifetime fitting methods with low photon numbers[25,26,31,35,36].

3.3 成像質量和空間分辨率的提升

傳統FLIM技術由于光學衍射極限的存在,其成像的空間分辨率被限制在橫向250 nm左右、軸向500 nm左右.結合近幾年來快速發展的超分辨成像等先進技術,FLIM的成像質量和空間分辨率得到了大幅提升.

通過引入自適應光學技術進行像差校正,可大幅提升FLIM的成像質量.例如,Feeks和Hunter[41]在利用雙光子激發FLIM對小鼠視網膜細胞進行成像以研究視網膜退化過程的工作中,通過引入自適應光學技術校正小鼠眼球引起的像差,同時實現了橫向與軸向的緊聚焦,抑制了背景噪聲及散射光,實現了對單個細胞的分辨,進而將這種方法運用到臨床醫學的檢眼鏡檢查法中,用于對視網膜細胞的健康狀況進行評價.

此外,針對前面提到的寬場FLIM受離焦信號影響,軸向分辨率和成像深度均較差的問題,Hinsdale等[42]嘗試將門控FLIM與結構光照明顯微術(structured illumination microscopy,SIM)結合,Greger等[43]嘗試將寬場頻域FLIM與單面照明顯微術(single plane illumination microscopy,SPIM)結合,從而使寬場FLIM也具備“光學層析”能力,實現了厚樣品的FLIM成像.

FLIM空間分辨率的大幅提升則主要是通過將已有的FLIM成像方法與超分辨成像技術結合來實現的,其中目前研究較多的是利用受激輻射耗盡(stimulated emission depletion,STED)技術來實現超分辨FLIM成像.例如,英國倫敦帝國理工學院French等[44,45]將STED與TCSPC-FLIM技術結合,通過將掃描光斑大小控制在100 nm以內獲得了超衍射極限的FLIM圖像,結果如圖3(a)所示.在該工作中,他們還利用基于空間光調制器(spatial light modulator)的數字全息術對STED光束進行相位調控,實現對其輪廓的整形和像差補償,在提升橫向分辨率的同時,大幅提升了軸向分辨率(由685 nm提升到362 nm)[46].浙江大學劉旭課題組采用連續光作為STED光,TCSPC技術測量熒光壽命,結合納米定位臺對樣品進行掃描,實現了STED-FLIM成像,成像分辨率達到了70 nm(如圖3(b)所示)[47].深圳大學屈軍樂課題組將STED-FLIM技術與自適應光學技術相結合,用于改善STED光的成像質量并校正由厚樣品散射引起的像差,進一步提升了成像分辨率[48,49].此外,French等[50]還將SIM與FLIM相結合,用于對膠原蛋白活化后COS細胞中DDR1受體低聚化的FRET過程進行研究.

圖3 結合STED超分辨技術實現FLIM空間分辨率的提升 (a)ATTO 647 N標記的NK細胞的STED-FLIM超分辨熒光壽命圖像(分辨率60 nm)[44];(b)直徑20 nm熒光珠的CW-STED與共聚焦熒光壽命圖像的對比(分辨率70 nm)[47]Fig.3.Improvement in FLIM spatial resolution by combining with STED super resolution imaging:(a)STED-FLIM super resolution fluorescence lifetime image of ATTO 647 N labeled NK cells(resolution 60 nm)[44];(b)CW-STED vs.confocal fluorescence lifetime image of 20 nm diameter fluorescent beads(resolution 70 nm)[47].

表2 FLIM成像性能提升的最新研究進展Table 2.Recent progress on improving FLIM imaging performance.

綜上,FLIM成像性能提升的最新進展總結于表2.

4 FLIM技術在生物醫學領域的應用研究

如前所述,FLIM除了具備一般熒光顯微成像的高特異性、高靈敏度等特點,還具有對微環境變化敏感、可定量測量等獨特的優勢,因此近二十年來已在各領域得到較為廣泛的應用,尤其是在生物醫學基礎研究、疾病診斷與治療研究,以及納米材料的生物醫學應用研究等方面,近年來FLIM的應用已取得許多利用傳統的研究手段無法獲取的數據,從而為這些領域的快速發展助力.

4.1 FLIM在生物醫學基礎研究中的應用

盡管近幾十年來生物醫學研究已經取得了巨大的發展,人們對于細胞行為及其機理的研究已經越來越深入細致,但仍然有許多重要問題需要繼續尋求答案,例如目前關于細胞生理代謝過程機理、信號轉導通路和機理、植物細胞光合作用機理等的研究仍然是細胞生物學研究中的熱點問題.FLIM可用于定量監測細胞中微環境變化的優勢恰好為這些問題的研究提供了一種很好的手段.例如,最近美國Walsh等[51]利用一種壽命對鈣離子濃度非常敏感的熒光探針(Oregon Green BAPTA-1)對小鼠海馬體神經元進行FLIM成像,實時觀察了神經元在光刺激前后鈣離子濃度的變化,并發現利用近紅外脈沖光照射時可引起神經元細胞內鈣含量的顯著增加,如圖4(a)所示.French課題組[46]則運用FLIM技術研究了肌肉纖維的肌節分子結構及免疫突觸信號的傳導過程.為了便于對大量采集數據的分析與整理,他們還將FLIM技術與高內涵細胞成像分析技術(high content analysis,HCA)結合,實現了FLIM的全自動成像,并基于熒光共振能量轉移( fluorescence resonance energy transfer,FRET)對蛋白質之間的相互作用進行分析[52,53].結合了HCA的FLIM成像設備使得我們可以從大量的FLIM圖像中自動篩選出有價值的數據,這在發現化學藥物、研究細胞分子相互作用中將發揮重要的作用.

在植物細胞生物學研究方面,2016年中國科學院田文明等[54]采用基于LSCM的FLIM技術,研究了光合系統的能量II傳遞機理,從而獲取了光合色素在光合作用中傳遞能量的速率信息.荷蘭Blilou等[55]在發表于《Nature》的工作中,利用FRET-FLIM技術實現了植物體內蛋白質相互作用的可視化研究,從而深入揭示了根尖細胞發育的分子機理(如圖4(b)所示).日本Kodama[56]利用FLIM技術獲得了熒光蛋白標記的向光素(一種位于葉綠體外圍的藍光感受器)的清晰圖像.FLIM在植物細胞研究中的應用難點之一就是植物內葉綠體自發熒光的干擾,因為在傳統FLIM成像條件下僅通過采用合適的發射波長與激發波長是很難完全消除葉綠體的自體熒光影響的.該課題組利用葉綠體自體熒光壽命較短(僅為ps量級)的特點,采用簡單的時間延遲門控成像技術來消除它們的影響.Camborde等[57]采用具有高時間分辨率的條紋相機探測FLIM圖像,并通過減小掃描視場縮短采集時間,從而結合FRET技術檢測了植物葉片中核酸與蛋白質的相互作用.

4.2 FLIM在疾病診斷與治療方面的應用

利用FLIM技術對臨床上一些典型疾病進行診斷及治療的研究也是近年來的一個前沿研究熱點.研究者們通常采用動物自體熒光壽命來研究體內細胞的代謝狀況,從而引導臨床上的疾病診斷與治療.Robert等[58]對患有黑色素瘤小鼠的單層上皮細胞進行多光子FLIM成像,通過細胞內的內源性熒光物質輔酶煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NADH)在游離態和結合態的含量比率來實現成像,從而監測腫瘤的動態發展進程.結果發現,在腫瘤成長過程中,該比率會顯著增大,但NADH自身長/短壽命組分的比例則基本保持不變.該工作表明,FLIM技術可以非侵入式、高靈敏、快速地反映黑色素瘤的發展進程,將在診斷及治療黑色素瘤中發揮重要作用.此外,由于NAD(P)H、黃素腺嘌呤二核苷酸( flavin adenine dinucleotide,FAD)、色氨酸(tryptophan,Trp)等內源性熒光物質及NAD(P)H與FAD的氧化還原比例能反映活細胞或組織內的代謝狀況,利用FLIM技術監測這些生化參數的變化還能用于實時反映抗癌藥物的治療效果.Alam等[59,60]利用三通道多光子TCSPC-FLIM技術,獲取了運用抗癌藥物治療前后前列腺癌細胞內這幾種物質的熒光壽命,結果表明治療后它們的平均熒光壽命增加,且NAD(P)H,FAD的氧化還原比例下降,從而反映了抗癌藥物的治療效果(如圖5(a)所示).在此基礎上,他們又運用FRET-FLIM技術研究了前列腺癌細胞內Trp的構造變化與Trp-NADH相互作用之間的關系.而Shirmanova等[61]則利用FLIM技術研究了培養的癌細胞或動物體內腫瘤在自然生長和化學治療兩種情況下的生物能量代謝及微觀黏度變化,通過NADPH自體熒光壽命的測量發現了治療后癌細胞的游離態NADPH相對含量減小,且質膜黏滯度顯著增大.哥倫比亞大學Kaminski等[62]利用熒光染料的自猝滅效應可影響其自身熒光壽命從而反映淀粉狀蛋白結構的性質(如圖5(b)所示),發展了一種可反映淀粉狀蛋白聚集狀態的FLIM傳感器,該傳感器動態范圍寬,測量時對蛋白質聚集過程不會產生干擾,且能高通量、定量地反映淀粉類蛋白的聚集狀態.在此基礎上他們采用SIM-FLIM技術對阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)相關蛋白τ的K18蛋白片段及與亨廷頓氏病(Huntington’s disease,HD)相關的聚谷氨酰胺蛋白進行了研究,對診斷和治療臨床上的神經退化疾病具有較大意義.

圖4 FLIM在生物醫學基礎研究中的應用 (a)FLIM用于鈣離子濃度變化的定量監測[51];(b)FLIM結合FRET用于分析擬南芥根尖細胞發育機理[55]Fig.4.Applications of FLIM in basic biomedical research:(a)FLIM applied for quantitative monitoring of calcium ion concentration[51];(b)FLIM combined with FRET for analyzing the development mechanism of Arabidopsis root tip cells[55].

圖5 FLIM在疾病診斷與治療方面的應用 (a)前列腺癌細胞中Trp,NAD(P)H,FAD在治療前后的平均壽命變化監測[60];(b)不同標記比例和孵育時間下K18-Atto532淀粉狀蛋白在體內的聚集狀態[62];(c)phasor-FLIM用于區分AK,BD,BCC等不同的皮膚疾病[66]Fig.5.Applications of FLIM in diagnosis and treatment of diseases:(a)Monitoring changes of the mean lifetime of Trp,NAD(P)H,and FAD in prostate cancer cells before and after treatment[60];(b)aggregation of K18-Atto532 amyloid in vivo at different labeling ratios and incubation times[62];(c)phasor-FLIM applied for differentiating different skin diseases such as AK,BD and BCC[66].

在國內也有多個課題組在開展FLIM技術的疾病診療研究.華東師范大學田陽等合成了一種具有高特異性、高雙光子吸收截面和低毒性的新型鋅離子熒光比率探針,并用于活細胞內鋅離子的FLIM成像,結果發現相比正常小鼠,患AD的小鼠其海馬組織中的鋅離子濃度要更高[63].上海理工大學宋成利等[64]對比分析了正常鼻咽及癌變組織中自體熒光壽命,并研究了生理鹽水及組織自身光學特性對熒光壽命測量的影響.南京中醫藥大學金路[65]運用多光子激發FLIM技術研究了大鼠病理狀態下肝臟的形態學結構及代謝情況,對臨床上脂肪肝的檢測與治療具有重要的參考意義.深圳大學Luo等[66]對蘇木精伊紅(hematoxylin and eosin)染色的病理切片進行雙光子FLIM成像,并通過引入相量分析法對熒光壽命進行分區和篩選,發展了一種可區分基底細胞癌(basal cell carcinoma,BCC)、光化性角化病(actinic keratosis,AK)和博文病(Bowen disease,BD)等不同皮膚疾病的方法,顯著提高了診斷的準確性,為組織病理學分析提供了一種簡單可行的新方法(如圖5(c)所示).

4.3 FLIM在納米材料生物醫學研究中的應用

隨著納米技術的快速發展,應用于生物醫學成像的新型納米材料也在不斷涌現.目前常見的新型納米材料有上轉換材料、量子點(quantum dot,QD)、碳量子點、金納米顆粒及其他納米顆粒[67].納米材料的制備和應用是一個非常活躍的研究領域,上述的納米材料一般都具有較好的光學性質,但具體應用于生物醫學成像和研究中則還有諸多問題和未知效應需要研究和探索.例如量子點的光穩定性較好,不易漂白,但由于具有微毒性,其生物安全性一直備受爭議.基于這些納米材料獨特的光學性質,FLIM為納米材料在生物醫學中的應用研究提供了一種新的思路.例如,英國愛丁堡大學Giraud等[68]利用FLIM技術研究了QD標記在DNA雜交事件檢測中的應用,并通過時間門控探測將QD的微陣列壽命圖像對比度提高了1.8倍,從而達到飛摩爾的靶向靈敏度.澳大利亞昆士蘭大學Lin等[69]與德國BH公司Becker合作,采用TCSPCFLIM技術對注射了氧化鋅納米顆粒的志愿者皮膚進行了FLIM成像并研究其代謝狀態,從而為該納米粒子在皮膚中的滲透和生物效應研究發展了一種非侵入性的成像和檢測手段.德國Chen等[70]制備了兩種類型的脫鎂葉綠酸-HSA(Pheo-HSA)納米顆粒,并利用LSCM-FLIM對它們在細胞內的藥物釋放過程進行研究,從而得出這種納米粒子可作為光動力治療(photodynamic therapy)藥物載體的結論.深圳大學Luo等[71]利用基于相量分析的FLIM技術對合成的聚合物納米粒子PAHCit/多柔比星(doxorubicin,DOX)的藥物釋放過程進行成像,通過監測細胞間質中DOX熒光壽命的動態變化來評估納米載體的藥物釋放效率.吉林大學Zhang等[72,73]將雙光子激發FRET-FLIM技術與表面等離子體激元共振技術結合,利用增強型的能量轉移發展了一種可以監測金納米顆粒在活細胞內的內吞過程的新方法,這對于研究體內和體外的生物成像傳感及單分子追蹤都有很大幫助.

5 總結與展望

熒光顯微成像具有高特異性、高靈敏度等特點,在生物醫學等領域有著廣泛的應用,其中利用熒光分子的壽命進行成像的FLIM技術更是由于具有能定量反映微環境參數分布和變化的獨特優勢而成為一種重要的研究工具.FLIM技術分為頻域法和時域法兩類,其中時域法又有門控法、條紋相機法和TCSPC法等.TCSPC-FLIM因同時具有高時間分辨率、高信噪比、寬動態范圍和不受激發光強度波動等因素影響等優點而成為目前應用最廣泛的FLIM技術.近年來FLIM技術的發展主要側重于成像性能的提升和應用范圍的拓寬這兩方面.TCSPC模塊和PMT性能的進一步改善、AOD尋址掃描方式的應用一定程度上提升了FLIM的成像速度,而SPAD陣列的發展及其與TCSPC結合發展起來的寬場TCSPC-FLIM則有望大幅提升成像速度;壽命擬合算法和解卷積算法的改進有利于在快速FLIM成像的前提下進一步提升壽命測量的精度;基于自適應光學的像差校正技術使得FLIM的成像質量進一步提升,而超分辨顯微成像技術與FLIM的結合則大幅提升了成像的空間分辨率,獲得了超分辨FLIM圖像.基于FLIM成像技術上的這些進步,目前FLIM在細胞生物學中一些重要科學問題的研究、臨床醫學上一些重大疾病的診斷與治療研究,以及納米材料的生物醫學應用研究等方面均有廣泛應用,并取得了許多利用傳統的研究手段無法獲取的數據.但是另一方面,目前FLIM的成像速度總體而言仍然不夠快,或者說在進行快速FLIM成像時仍然不能夠獲得精度足夠高的壽命數據,因此FLIM的成像性能還有待進一步提升.相信未來隨著激光技術、探測器技術、超分辨成像等相關技術的快速發展,同時結合算法和熒光探針合成技術的進步,FLIM技術在成像速度、測量精度、成像空間分辨率等方面的性能還將得到進一步提升,從而可在更多領域發揮更重要的作用.