不同來(lái)源蛹蟲(chóng)草核苷類成分分析*

李建平，張 鐵，曾文波**，馬小雙

（1．文山學(xué)院環(huán)境與資源學(xué)院，云南 文山 663099；2．文山學(xué)院文山州生物資源開(kāi)發(fā)研究中心，云南 文山 663099）

蛹蟲(chóng)草Cordyceps militaris(Fr.)Link.，又稱作北冬蟲(chóng)夏草，隸屬于艷蟲(chóng)草科（Cordycipitaceae） 蟲(chóng)草菌屬（Cordyceps），蛹蟲(chóng)草是其無(wú)性型蛹草擬青霉感染鱗翅目昆蟲(chóng)蛹形成的蟲(chóng)菌復(fù)合體[1-2]，野生蛹蟲(chóng)草分布廣[3]，但是產(chǎn)量較低，無(wú)法滿足市場(chǎng)的需求。目前，蛹蟲(chóng)草已經(jīng)實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化、規(guī)模化培養(yǎng)[4]，價(jià)格低至100元·kg-1。由于蛹蟲(chóng)草與冬蟲(chóng)夏草含有相似的化學(xué)成分[5]，常被用作冬蟲(chóng)夏草的代用品。

蛹蟲(chóng)草具有補(bǔ)腎，恢復(fù)肝功能，調(diào)節(jié)人體免疫系統(tǒng)，抗腫瘤，抗氧化和調(diào)節(jié)心血管功能等多種藥理功效[6-11]，蛹蟲(chóng)草等蟲(chóng)草真菌含有水溶性核苷類成分、多糖、蟲(chóng)草酸和總黃酮等多種活性成分[12-13]，其中核苷類成分主要包括尿嘧啶、腺嘌呤、尿苷、肌苷、鳥(niǎo)苷、胸苷、腺苷、2’-脫氧腺苷、2’-脫氧尿苷和蟲(chóng)草素等[14]，腺苷具有減少心律，影響心肌收縮力，松弛血管平滑肌，抑制脂肪分解，減少腎血流量和腎素釋放，減少兒茶酚胺釋放，抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)，增加cAMP等多種藥理功效[15]。蟲(chóng)草素（cordycepin），即 3’-脫氧腺苷 （3’-deoxyadenosine），是1種核苷類似物，與腺苷結(jié)構(gòu)相比，缺少3’-OH，但能參與如基因表達(dá)、嘌呤合成等生化反應(yīng)，也能影響細(xì)胞周期、血小板凝集、炎癥反應(yīng)、腫瘤轉(zhuǎn)移等生理、病理進(jìn)程。研究表明，蟲(chóng)草素具有抗病原微生物、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等藥理功效[16]，此外，蟲(chóng)草素在對(duì)抗代謝紊亂、氧化損傷、治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病等方面也具有較好的療效[17]。肌苷是1種次黃嘌呤核苷制劑，能透過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)，可提高多種酶的活性，參與能量代謝和蛋白質(zhì)合成。臨床上常用來(lái)治療缺血性心臟病，具有抗心律失常的功效[18]。

人工培養(yǎng)的蛹蟲(chóng)草于2009年被批準(zhǔn)為“新資源食品”（后更名為“新食品原料”），是目前唯一可作為食品的蟲(chóng)草類真菌（Cordyceps-like fungi）[19]。蛹蟲(chóng)草現(xiàn)已成為十分常見(jiàn)的藥食兩用真菌之一，分為鮮品和干品，市面上售賣的主要是蛹蟲(chóng)草的干品，在超市和農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)一般都能購(gòu)買到。經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，蛹蟲(chóng)草產(chǎn)地眾多，多數(shù)產(chǎn)品未標(biāo)出其有效成分，沒(méi)有統(tǒng)一的生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)和產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，亟待開(kāi)展蛹蟲(chóng)草相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)研究。

本文收集了產(chǎn)自遼寧、吉林、黑龍江、內(nèi)蒙古、陜西、廣東、福建、云南、西藏、安徽、廣西、湖北、江西等不同地區(qū)共計(jì)30個(gè)批次的蛹蟲(chóng)草樣品，采用超高效液相色譜法（UHPLC）測(cè)定了其中的尿嘧啶、尿苷、肌苷、鳥(niǎo)苷、腺嘌呤、胸苷、腺苷、2’-脫氧腺苷、蟲(chóng)草素9種核苷類成分，使用SPSS軟件對(duì)核苷類成分含量數(shù)據(jù)進(jìn)行描述性分析和聚類分析，另外，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版），計(jì)算了30個(gè)蛹蟲(chóng)草樣品核苷類成分相似度，為評(píng)價(jià)不同來(lái)源蛹蟲(chóng)草質(zhì)量提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

購(gòu)買產(chǎn)地明確的蛹蟲(chóng)草材料，樣品來(lái)源、生產(chǎn)企業(yè)和商家詳見(jiàn)表1。分別稱取30 g左右蛹蟲(chóng)草，60℃烘干2 h，打粉過(guò)80目篩，備用。

表1 蛹蟲(chóng)草樣品來(lái)源Tab.1 The sources of Cordyceps militaris

尿嘧啶、尿苷、肌苷、鳥(niǎo)苷、腺嘌呤、胸苷、腺苷、2’-脫氧腺苷等標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司，純度為98%以上；蟲(chóng)草素購(gòu)自上海詩(shī)丹德生物技術(shù)有限公司，純度為98%；甲醇，色譜純，Merck KGaA Darmstadt,Germany；娃哈哈純凈水。其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

熱電ULTIMATE 3000超高效液相色譜儀（LPG-3400SDN四元梯度泵，WPS-3000SL自動(dòng)進(jìn)樣器，VWD-3100可變波長(zhǎng)檢測(cè)器，TCC-3000RS柱溫箱，Syncronis C18，1.7 μm，4.6 mm×150 mm 色譜柱，“變色龍”控制分析色譜工作站軟件），賽默飛世爾科技（中國(guó)） 有限公司；SK5200超聲波清洗器，上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司；50 g手提式高速萬(wàn)能粉碎機(jī)，溫嶺市林大機(jī)械有限公司；低速離心機(jī)（4 000 r·min-1），上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

流動(dòng)相為甲醇-水（12:88）；等度洗脫，流速0.4 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm；柱溫35℃。在該色譜條件下，尿嘧啶、尿苷、肌苷、鳥(niǎo)苷、腺嘌呤、胸苷、腺苷、2’-脫氧腺苷和蟲(chóng)草素等成分色譜峰均能較好地分離，見(jiàn)圖1。

1.3.2 對(duì)照品溶液的配制

圖1 蛹蟲(chóng)草核苷類成分UHPLC圖譜Fig.1 UHPLC chromatograms of nucleosides in Cordyceps militaris

分別稱取干燥至恒重的尿嘧啶、尿苷、肌苷、鳥(niǎo)苷、腺嘌呤、胸苷、腺苷、2’-脫氧腺苷和蟲(chóng)草素對(duì)照品各2 mg～5 mg，使用20%甲醇溶解并定容至50 mL。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別吸取對(duì)照品溶液 1.0 μL、2.0 μL、4.0 μL、8.0 μL、10.0 μL，注入液相色譜儀中，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，以標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣量（換算成標(biāo)準(zhǔn)品重量） 為縱坐標(biāo)（y），峰面積為橫坐標(biāo)（x），求回歸方程，詳見(jiàn)表2。

1.3.4 蛹蟲(chóng)草供試液的制備

參考李建平和曾文波[20]的樣品處理方法，制備蛹蟲(chóng)草樣品供試液。精密稱取0.150 g左右蛹蟲(chóng)草樣品于15 mL離心管中，加入20%甲醇溶液3 mL，蓋緊，混勻，超聲處理60 min，放至室溫，4 000 r·min－1離心15 min，將上清液轉(zhuǎn)至10 mL容量瓶中，按照上述方法再處理2次，合并上清液，定容至10 mL得樣品溶液，使用一次性注射器吸取樣品溶液，用0．22 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得供試液。

表2 核苷類成分的回歸方程Tab.2 Regression equation of 9 nucleoside components

1．3．5 核苷類成分含量測(cè)定

將處理好的樣品供試液，按照上述色譜條件，進(jìn)樣檢測(cè)，進(jìn)樣量為3 μL，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算樣品中的核苷類成分含量，取平均值。

1．3．6 數(shù)據(jù)分析方法

采用SPSS 19．0分析蛹蟲(chóng)草核苷類成分含量的基本統(tǒng)計(jì)量，包括最大值、最小值、平均值、標(biāo)準(zhǔn)差、變異系數(shù)等，并采用聚類分析對(duì)30個(gè)不同來(lái)源的蛹蟲(chóng)草樣品核苷類成分含量進(jìn)行分析。

采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版），評(píng)價(jià)30個(gè)蛹蟲(chóng)草樣品指紋圖譜相似性。

2 結(jié)果與分析

2.1 精密度試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液3 μL，按上述色譜條件連續(xù)測(cè)定5次，獲得各成分峰面積，分別計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。RSD 在 0．07%～0．45%。

2.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液3 μL，按上述色譜條件分別于2 h、6 h、12 h、24 h、36 h、48 h測(cè)定各成分峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，RSD在0．15%～2．25%，對(duì)照品在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3 重復(fù)性試驗(yàn)

分別稱取樣品（Cmi1） 0．1500 g共5份，按照1．3．4提及的方法處理得到的供試液，分別吸取樣品供試液各3 μL，按上述色譜條件測(cè)定核苷類成分的峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線將峰面積換算成對(duì)照品重量，計(jì)算出樣品中各成分含量，并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，RSD 在 0．98%～3．42%。

2.4 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取核苷類成分含量已知的蛹蟲(chóng)草樣品0．1500 g共3份，分別置于15 mL離心管中，按照上述方法，使用對(duì)照品溶液作為提取溶劑，處理得到的供試液，按上述色譜條件測(cè)定供試液中核苷類成分含量，計(jì)算尿嘧啶、尿苷、肌苷、鳥(niǎo)苷、腺嘌呤、胸苷、腺苷、2’－脫氧腺苷和蟲(chóng)草素的平均回收率 （n=3），回收率平均值在 96．93%～103．57%，RSD在 3．19%～5．83%。

2.5 核苷類成分含量

采用UHPLC法測(cè)定樣品中尿嘧啶、尿苷、肌苷、尿苷、腺嘌呤、腺苷和蟲(chóng)草素等成分的含量，詳見(jiàn)表3。

從表3可以看出，30個(gè)蛹蟲(chóng)草樣品中，9種核苷類成分含量最高的是產(chǎn)自陜西西安市的Cmi16樣品（10 294．16 μg·g－1），最低的是產(chǎn)自廣東陽(yáng)江市的Cmi20樣品（4 488．36 μg·g－1），平均值為8 115．06 μg·g－1，變異系數(shù)為 15．33%，表明不同來(lái)源蛹蟲(chóng)草（組間）核苷類成分總含量差異較小。

2.6 描述統(tǒng)計(jì)量

將表3數(shù)據(jù)輸入到SPSS軟件中，計(jì)算9種核苷類成分含量的最小值、最大值、極差、平均值、標(biāo)準(zhǔn)差及變異系數(shù)（CV值），詳見(jiàn)表4。

由表4可知，蛹蟲(chóng)草中尿嘧啶含量最小值為6．20 μg·g－1， 最 大 值 為 158．85 μg·g－1， CV 值 為72．03%；尿苷含量最小值為 578．30 μg·g－1，最大值為 2 848．38 μg·g－1，CV 值為 25．69%；肌苷含量最小值為 17．41 μg·g－1，最大值 274．09 μg·g－1，CV 值為50．03%；鳥(niǎo)苷含量最小值為 1 169．53 μg·g－1，最大值 3 513．22 μg·g－1，CV 值為 28．72%；腺嘌呤含量最小值為 14．56 μg·g－1，最大值 116．35 μg·g－1，CV 值為44．29%；胸苷含量最小值為0（未檢出），最大值62．40 μg·g－1，CV 值為 57．91%；腺苷含量的最小值為 1 304．05 μg·g－1，最大值 2 893．37 μg·g－1，CV 值為 16．28%；2’－脫氧腺苷含量最小值為 5．60 μg·g－1，最大值 49．02 μg·g－1，CV 值為 35．76%；蟲(chóng)草素含量最小值為 821．67 μg·g－1，最大值 3 555．27 μg·g－1，CV 值為 39．51%。

結(jié)果表明，蛹蟲(chóng)草中9種核苷類成分含量高低依次為腺苷、鳥(niǎo)苷、尿苷、蟲(chóng)草素、肌苷、腺嘌呤、尿嘧啶、2’－脫氧腺苷、胸苷，其中，腺苷、鳥(niǎo)苷、尿苷和蟲(chóng)草素是蛹蟲(chóng)草中主要的核苷類成分，占到9種核苷類成分的96．03%；9種核苷類成分變異系數(shù)（CV值） 在16．28%～72．03%，由低到高依次為腺苷、尿苷、鳥(niǎo)苷、2’－脫氧腺苷、蟲(chóng)草素、腺嘌呤、肌苷、胸苷、尿嘧啶，這表明腺苷是9種核苷類成分中含量最高、最為穩(wěn)定的1個(gè)成分，蟲(chóng)草素是4種主要核苷類成分中變異最大的成分。此外，各個(gè)核苷類成分的CV值均高于核苷類成分總含量的CV值（15．33%），表明不同來(lái)源蛹蟲(chóng)草核苷類成分總含量差異較小，但具體到各個(gè)核苷類成分則有較大的差異，這可能與其菌種和培養(yǎng)條件有關(guān)。

表3 不同來(lái)源蛹蟲(chóng)草核苷類成分含量Tab.3 Content of nucleosides in Cordyceps militaris from different sources

表4 不同來(lái)源蛹蟲(chóng)草核苷類成分含量分析結(jié)果Tab.4 The analysis on nucleosides in Cordyceps militaris from different sources

2.7 聚類分析

將表3數(shù)據(jù)輸入到SPSS軟件中，選擇菜單中“分析—分類—系統(tǒng)聚類”，選擇9種核苷類成分作為變量，樣品編號(hào)作為標(biāo)注個(gè)案，統(tǒng)計(jì)量選擇合并進(jìn)程表、相似性矩陣，繪制選擇水平樹(shù)狀圖，以聚類方法為組間聯(lián)接，區(qū)間選擇Pearson相關(guān)性，其他參數(shù)為默認(rèn)值，繪制30個(gè)蛹蟲(chóng)草樣品聚類樹(shù)狀圖，見(jiàn)圖2。

圖2 不同來(lái)源蛹蟲(chóng)草核苷類成分聚類圖Fig．2 Dendrogram of cluster analysis of nucleosides in Cordyceps militaris from different sources

由圖2可知，樣品Cmi1、Cmi2、Cmi3、Cmi4、Cmi5、Cmi6、Cmi9組成了分枝 A，其中，除了Cmi9產(chǎn)自吉林長(zhǎng)春以外，其余6個(gè)樣品均產(chǎn)自遼寧沈陽(yáng)；分枝B由產(chǎn)自吉林延吉（Cmi7、Cmi8）、黑龍江 （Cmi10）、內(nèi)蒙古 （Cmi11、Cmi12、Cmi13、Cmi14、 Cmi15）、 廣 東 （Cmi18）、 福 建 泉 州（Cmi21、Cmi22）、西藏 （Cmi25、Cmi26）、安徽（Cmi27）、廣西（Cmi28） 江西（Cmi30） 15個(gè)樣品構(gòu)成；分枝C由產(chǎn)自陜西（Cmi16）、云南（Cmi23）和湖北（Cmi29）的樣品構(gòu)成；分枝F包括產(chǎn)自廣東（Cmi17、 Cmi20）、云南臨 滄 （Cmi24）、 廣 西（Cmi28） 4個(gè)樣品；分枝 H由產(chǎn)自廣東韶關(guān)（Cmi19） 的樣品構(gòu)成。分枝A與分枝B構(gòu)成分枝D，依次與分枝C、分枝F相聯(lián)構(gòu)成分枝G，最后與分枝H相聯(lián)形成樹(shù)形聚類圖。中國(guó)的分區(qū)圖見(jiàn)圖3。

圖3 中國(guó)分區(qū)圖Fig．3 Geographical zoning map of China

根據(jù)中國(guó)的分區(qū)圖，分枝A代表了以沈陽(yáng)為主的東北來(lái)源的蛹蟲(chóng)草；分枝B和分枝C中的樣品包括東北（3個(gè)）、華北（5個(gè)）、華東（4個(gè)） 華南（2個(gè)）、西南（3個(gè)）、西北（1個(gè)）15個(gè)樣品，代表了由北至南過(guò)渡地帶的樣品；分枝F和分枝H全部由西南（1個(gè)）和華南（4個(gè)）的南方樣品構(gòu)成，代表了南方產(chǎn)地的蛹蟲(chóng)草樣品，由圖2可知，根據(jù)蛹蟲(chóng)草中9種核苷類成分含量生成的聚類圖，能較好地反映其樣品的來(lái)源，即蛹蟲(chóng)草中核苷類成分的含量具有一定的地理相關(guān)性。

2.8 指紋圖譜相似度分析

使用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）評(píng)價(jià)30個(gè)蛹蟲(chóng)草樣品指紋圖譜相似性。該軟件的使用包括圖譜導(dǎo)入、設(shè)置參照?qǐng)D譜（以平均數(shù)法作為對(duì)照指紋圖譜的生成方法，設(shè)定時(shí)間窗寬度為0．3 min）、保留時(shí)間多點(diǎn)校正、譜峰自動(dòng)匹配、生成對(duì)照?qǐng)D譜和相似度計(jì)算等幾個(gè)主要步驟。根據(jù)峰匹配結(jié)果，選取峰圖時(shí)間段為0～35 min，計(jì)算樣品指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜的整體相似度。不同來(lái)源蛹蟲(chóng)草間相似度及其與對(duì)照指紋圖譜相似度見(jiàn)表5。

由表 5 可知，樣品間相似度在 0．69～0．99，兩兩比較相似度在0．90以上的比例為79．77%（347/435×100%=79．77%），30個(gè)樣品與對(duì)照指紋圖譜的相似度在0．84～0．99，結(jié)果顯示不同來(lái)源蛹蟲(chóng)草核苷類成分相似度較高，但仍然存在一定差異。

3 討論

本文測(cè)定了30個(gè)不同來(lái)源的蛹蟲(chóng)草樣品中的9種核苷類成分，并比較了其指紋圖譜的相似性，表明不同來(lái)源蛹蟲(chóng)草核苷類成分種類及其總量差異較小，樣品間核苷類成分整體相似度較高，但仍然存在一定的差異，這可能是受菌種來(lái)源不同[21]，不同產(chǎn)地培養(yǎng)條件的差異，如培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)時(shí)間、溫度、濕度、光照等多種因素的影響[22]。蛹蟲(chóng)草已經(jīng)被批準(zhǔn)為新食品原料，可應(yīng)用到食品、保健食品和藥品等多個(gè)行業(yè)，因此應(yīng)從篩選優(yōu)良菌株、優(yōu)化培養(yǎng)條件等方面著手，制定蛹蟲(chóng)草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)范蛹蟲(chóng)草栽培和應(yīng)用，進(jìn)一步提高蛹蟲(chóng)草中有效成分含量及其質(zhì)量的穩(wěn)定性。

表5 不同來(lái)源蛹蟲(chóng)草核苷類成分指紋圖譜相似度Tab.5 Results of similarity analysis of nucleosides in Cordyceps militaris from different sources

腺苷、鳥(niǎo)苷、尿苷和蟲(chóng)草素是蛹蟲(chóng)草中主要的核苷類成分，其中，腺苷的變異系數(shù)最小，表明腺苷成分較為穩(wěn)定，可作為蛹蟲(chóng)草質(zhì)量控制的主要指標(biāo)之一；蟲(chóng)草素具有多種藥理功效，是蛹蟲(chóng)草中重要的活性成分，也應(yīng)作為1項(xiàng)重要的質(zhì)量控制指標(biāo)，但其變異系數(shù)較大，含量不穩(wěn)定，這也可能是由不同廠家的菌種來(lái)源、培養(yǎng)條件、加工等方面的差異造成的。因此急需制定統(tǒng)一可靠的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，確定人工蛹蟲(chóng)草的質(zhì)量等級(jí)，保障人工蛹蟲(chóng)草的質(zhì)量可控。