高壓超臨界CO2提取靈芝三萜和甾醇成分的研究

華正根 ，王金亮 ，2，朱麗萍 ，吳長輝 ，2，姚渭溪 ，2，李 曄 *

（1．福建仙芝樓生物科技有限公司，福建 福州 350002；2．國家食用菌加工技術研發分中心，福建 福州 350002）

靈芝（Ganoderma lucidum） 又稱瑞草、仙草，性平味甘，為我國名貴的傳統中藥材，一直被中華傳統醫學視為滋補強身、固本扶正的珍貴中草藥。

靈芝的成分豐富，包括靈芝多糖、三萜及甾醇成分、核苷、蛋白質和微量元素等，其中靈芝三萜和甾醇成分以及靈芝多糖是最主要的活性物質，近年來一直是研究的重點。現代醫藥學研究靈芝及其提取物發現，靈芝三萜類化合物具有抗腫瘤、保肝，降低血糖，抑制血管緊張素、抗氧化等功效[1]；靈芝多糖具有抗腫瘤、衰老，提高免疫力，清除自由基，降低血糖等功效[2]；靈芝甾醇具有增強人體抵抗疾病的能力，降低血液中的膽固醇濃度，預防前列腺疾病等功效[3]。這些成分各起作用，且成分之間又有協同作用。

目前，對靈芝中的靈芝多糖、三萜成分研究較多[4－5]，對靈芝甾醇類化合物的研究相對較少。在傳統的提取工藝中，提取靈芝中三萜及甾醇類化合物的方法通常有乙醇回流提取法、有機溶劑提取法、微乳提取法，為了能夠更加有效地提高溶劑的提取效率，需要新技術的輔助，如超聲波、微波等輔助提取[6]。

超臨界CO2提取技術，自20世紀60年代在咖啡豆內脫除咖啡因、提取啤酒花浸膏等方面實現產業化后，在食品香料、化工材料、中醫中藥和環境保護等領域獲得廣泛應用。由于高壓密封及其安全等方面的限制，目前超臨界CO2提取的產業化設備的提取壓力大多在35 MPa。鑒于CO2的非極性特性，提取脂溶性成分主要采用35 MPa的超臨界CO2提取壓力，若提取低極性成分，通常需要在CO2中添加少量的極性溶劑（例如乙醇）作為夾帶劑，但是，如果想要除去進入提取物中的極性溶劑，也會帶來許多新問題。隨著技術進步，當前許多超臨界CO2產業化設備能達到50 MPa，與提取壓力35 MPa設備相比，壓力的提高使超臨界CO2的密度增大，提高了提取能力，而且不添加夾帶劑，除了能提取脂溶性成分外，還能提取部分低極性成分。在有關單位協助下，使用105 MPa的高壓超臨界CO2設備采用梯度高壓對提取的靈芝成分進行了初探，試驗表明提高超臨界CO2設備的提取壓力，能夠增加超臨界CO2介質的密度和溶解能力，能從靈芝細粉中提取出更多的靈芝三萜和甾醇成分，將為靈芝提取提供新方法。

1 材料與方法

1.1 試劑

甲醇、乙腈為色譜純；水為實驗室自制超純水；靈芝細粉（40目～60目），福建仙芝樓生物科技有限公司自制；靈芝酸A、B、C1標準品，中國藥品生物制品檢定所；麥角甾醇，福建省食品藥品檢定研究院。

1.2 儀器

LC－20AD液相色譜儀，日本島津公司；KQ－100E型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；A1140型萬分之一電子分析天平，美國奧豪斯儀器有限公司；DK－S28電熱恒溫水浴鍋，上海精科實業有限公司；超臨界提取裝置，德國伍德超臨界設備有限公司。

1.3 方法

1．3．1 超臨界CO2提取靈芝三萜及甾醇的研究

（1）超臨界工藝流程

超臨界工藝流程圖如圖1所示。

圖1 超臨界工藝流程圖Fig．1 Flow chart of supercritical process

（2） 高壓超臨界CO2提取試驗

按照超臨界CO2提取的工藝流程圖所示，將靈芝細粉1 kg裝入提取釜，按設定的溫度和CO2流量進行高壓提取，考察不同提取壓力（30 MPa、65MPa、85 MPa、105 MPa） 條件下的提取情況，從分離釜中收集提取物，于65℃進行干燥。稱取提取物0．10 g，加入乙醇20 mL，超聲處理45 min，定容，離心（轉速 4 000 r·min－1，離心 10 min） 得上清液，高效液相色譜測定靈芝三萜和甾醇的含量，計算靈芝三萜和甾醇的提取含量。靈芝中三萜和甾醇含量（N，%） 公式為：

式中：m1表示靈芝三萜和甾醇的質量，g；m2表示靈芝細粉的質量，g。

1．3．2 傳統乙醇回流提取試驗

稱取靈芝細粉，加入95%乙醇溶劑進行回流提取，提取工藝參數[7]：料液比1:10，提取溫度80℃，提取時間1．5 h，提取3次。

1．3．3 提取物樣品HPLC分析

（1）樣品溶液的制備

分別稱取乙醇回流提取法提取的醇提取物和高壓超臨界CO2提取法的提取物0．1 g，加甲醇，超聲溶解，4 000 r·min－1，離心 10 min，取上清液，0．45 μm濾膜濾過，上C18色柱譜。

（2）對照品溶液的制備

分別精密稱取5．0 mg的靈芝酸B、A、C1共3種靈芝酸標準品和麥角甾醇標準樣品，加入甲醇5．0 mL，分別配成 1．0 mg·mL－1的對照品溶液。

（3）靈芝三萜酸的高效液相色譜法測定

色譜條件：安捷倫 Eclipse XDB－C18柱 （4．6 mm×250 mm，5 μm），流動相：乙腈 （A） －甲醇（B） －0．4%甲酸水溶液（C），梯度洗脫程序為0時，A：20%，B：20%，C：60%；30 min時，A：30%，B：20%，C：50%；35 min時，A：38%，B：20%，C：42%；40 min時，A：20%，B：20%，C：60%；45 min時，A：20%，B：20%，C：60%；流速：1．0 mL·min－1，檢測波長：254 nm，柱溫：30℃，進樣量：10 μL。

按峰面積歸一化方法，將10 min～25 min所有峰的峰面積總和，以標準品靈芝酸B的質量和峰面積計算出這個范圍內總靈芝酸含量；25 min～29 min所有峰的峰面積總和，以標準品芝酸A的質量和峰面積計算出這個范圍內總靈芝酸含量；29 min～40 min所有峰的峰面積總和，以標準品芝酸C1的質量和峰面積計算出這個范圍內總靈芝酸含量，將這三個時間段計算出的靈芝酸含量相加即為靈芝三萜含量。

（4） 麥角甾醇的高效液相色譜法測定

色譜條件：安捷倫 Eclipse XDB－C18柱 （4．6 mm×250 mm，5 μm），流動相：甲醇 （A） －0．5%乙酸水溶液（B），梯度洗脫程序為0～45 min時，A：60%→100%；45 min～70 min時，A：100%～100%，流速：1．0 mL·min－1，檢測波長：282 nm，柱溫：35℃，進樣量：10 μL。

（5）靈芝三萜和甾醇成分的高效液相色譜圖對照

色譜條件：色譜柱，安捷倫Eclipse XDB－C18柱 （4．6 mm×250 mm，5 μm），流動相：甲醇 （A） －0．5%醋酸水（B），梯度洗脫程序為0～30 min時，A：50%→80%；30 min～35 min時，A：80%→85%；35 min～65 min時，A：85%→85%；65 min～70 min時，A：85%→95%；70 min～80 min時，A：95%→95%；80 min～85 min時，A：95%→100%；85 min～110 min 時，A：100%→50%，流速：1．0 mL·min－1，進樣量：10 μL，柱溫：30℃，檢測波長254 nm。

2 結果與分析

2.1 高壓超臨界CO2提取試驗內容和結果

設定提取溫度為50℃，提取時間為4．0 h，分離壓力為10 MPa，分離溫度為40℃，CO2流量為12 L·h－1，收集提取壓力分別為 30 MPa、65 MPa、85 MPa、105 MPa條件下的提取物，觀察靈芝三萜和甾醇成分含量的變化，結果見圖2。

圖2 提取壓力對靈芝三萜和麥角甾醇含量的影響Fig．2 Effect of extraction pressure on the content of triterpene and ergosterol in Ganoderma lucidum

提取壓力影響CO2的密度，是影響CO2溶解能力的重要因素。由圖2中可以看出，靈芝三萜和麥角甾醇含量隨著提取壓力的升高而增大，當提取壓力為85 MPa時，靈芝三萜含量為1．34%，麥角甾醇的含量達到0．32%，繼續升高壓力，超臨界CO2提取法的提取效率也隨之提高，但提取效率提高較少，并且提取壓力過高，會增加設備的損耗和成本。綜上所述，確定最佳提取壓力為85 MPa。其優化的工藝條件為：提取壓力85 MPa，提取溫度50℃，提取時間4 h，在此條件下，靈芝三萜含量為1．35%，麥角甾醇含量為0．32%。

2.2 高壓超臨界CO2提取法與乙醇回流提取法比較

靈芝三萜和甾醇成分的提取方法較多，但是普遍采用的是乙醇回流提取法。本試驗采用同一批次的靈芝細粉原料分別進行高壓超臨界提取法和乙醇回流提取法比較。

2．2．1 靈芝三萜成分比較

以靈芝酸B、A、C1作為標準品。結果見圖3、表1。

由圖3可以看出，在相同的樣品進樣濃度和體積條件下，高壓超臨界CO2提取法的提取物與乙醇回流提取法的提取物有同樣的峰形，可見2種方法都能將靈芝三萜成分提取出來，三萜含量高低不同。

表1結果表明，與乙醇回流提取法相比，高壓超臨界CO2提取法提取溫度較低，靈芝三萜和麥角甾醇含量分別比乙醇回流提取法高了46.7%、60%，而提取時間較乙醇回流提取法短。可見高壓超臨界CO2提取法具有耗時短、提取率高、效益高等優點。

圖3 高壓超臨界CO2提取法與乙醇回流提取法提取靈芝三萜的高效液相色譜圖Fig.3 High performance liquid chromatography(HPLC)of Ganoderma lucidum triterpene extracted by high pressure supercritical CO2extraction and ethanol reflux extraction

表1 高壓超臨界CO2提取方法與乙醇回流提取方法比較Tab.1 Comparison of high pressure supercritical CO2extraction and ethanol reflux extraction

2.2.2 甾醇成分的比較

以麥角甾醇作為標準品進行比較，結果見圖4、表1。

由圖4可以看出，在相同的樣品進樣濃度和體積條件下，在出峰時間56 min時，高壓超臨界CO2提取法的提取物與乙醇回流提取法的提取物有同樣麥角甾醇的峰，但前者麥角甾醉的含量比后者高。

2.2.3 高壓超臨界CO2提取法與乙醇回流提取法的HPLC圖譜比較

高壓超臨界CO2提取法與乙醇回流提取法的HPLC圖譜的比較結果見圖5。

由圖5可以看出，在相同的樣品進樣濃度和體積條件下，在20 min～40 min高壓超臨界CO2提取法的提取物的出峰個數比乙醇回流提取法的提取物多，而在其他出峰時間2種提取物的出峰數量、保留時間基本保持相同，色譜峰峰形也極其相似，這說明高壓超臨界CO2提取法提取出的三萜和甾醇成分的種類比乙醇回流提取法多。

圖4 高壓超臨界CO2提取法與乙醇回流提取法提取的麥角甾醇的高效相色譜圖Fig.4 High performance liquid chromatography(HPLC)of ergosterol extracted by high pressure supercritical CO2extraction and ethanol reflux extraction

圖5 高壓超臨界CO2提取和乙醇回流提取樣品的HPLC譜圖Fig.5 HPLC spectra of samples extracted by high pressure supercritical CO2extraction and ethanol reflux extraction

3 討論

超臨界CO2提取技術作為1種提取新工藝，因其提取時間短，無污染，產品品質好，同時有效地避免了傳統提取工藝對天然成分尤其是對熱敏性物質的影響而倍受青睞，具有廣闊的發展前景。本試驗以靈芝三萜和甾醇成分含量為考察指標，通過不同提取壓力試驗對超臨界CO2高壓提取工藝條件進行篩選，確定提取工藝條件為：提取壓力85 MPa，提取溫度50℃，提取時間4 h，CO2流量為12 L·h-1。試驗表明，隨著提取壓力的提高，超臨界CO2提取法的提取效率也隨之提高，但到達85 MPa時會趨于平衡，因此提取壓力不是越高越好。

由于靈芝三萜和甾醇成分難溶于水，易溶于乙醇、甲醇、氯仿等有機溶劑[8]，但因甲醇、氯仿毒性比乙醇大，且乙醇提取法是傳統的提取方法，故該試驗選擇將乙醇回流提取法和超臨界CO2提取法進行比較。結果表明，與乙醇回流提取法相比，高壓超臨界CO2提取法提取溫度較低，靈芝三萜和甾醇成分含量分別比乙醇回流提取法高出46.7%、60%，而提取時間較乙醇回流提取法短。可見超高壓CO2提取法具有提取率高、耗時短、效益高等優點。HPLC圖譜表明，高壓超臨界CO2提取法的提取物中三萜和甾醇成分種類較多。靈芝子實體主要成分由纖維素、半纖維素和木質素構成，纖維化結構高達80%以上，結構致密，具有較好的維持力，而靈芝成分附著于細胞壁、細胞內，較難滲出，在提取過程中，高壓力破壞了靈芝細胞表面的結構，使細胞內外的壓力差增大，超臨界CO2就能輕易地進入靈芝細胞內，靈芝中三萜和甾醇等成分被高效地提取出來。

高壓超臨界CO2提取法，由于對設備要求高、費用高、容積小等問題，目前該法尚處在研究探索的階段，但其對于其他物料的提取具有一定的參考價值。