秀珍菇原生質體高效制備與再生研究*

崔 曉，叢倩倩，王慶武，安秀榮

（泰安市農業科學研究院食用菌研究所，山東 泰安 271000）

秀珍菇（Pleurotus pulmonarius） 又名袖珍菇，學名為肺形側耳。20世紀后期由臺灣地區引進[1]，屬真菌門 （Mycobionta） 擔子菌綱 （Homobasidiomycetes） 傘菌目 （Agaricales） 側耳科 （Pleurotaceae） 側耳屬（Pleurotus）[2]。因其外形近似平菇，子實體朵形較小，在部分地區又被稱為“小平菇”。秀珍菇質地脆嫩，味道鮮美，且營養豐富，其不僅富含人體所需的氨基酸等營養物質，從中提取的多糖更具有抗腫瘤功效[3]。秀珍菇的市場前景廣闊，也為食用菌育種工作提供了優良親本。

原生質體育種是食用菌育種工作的重要內容，早期的原生質體分離主要采用機械法破除細胞壁，自英國學者Cocking發明了酶解法[4]后，開創了大量獲得原生質體的新技術。多年來，酶解法制備原生質體廣泛用于食用菌研究中。1972年，Vries和Wessels[5]用裂解酶酶解得到了裂褶菌原生質體。1989年毛木耳和黑木耳通過種間原生質體融合得到新品種[6]，90年代以來上海市農科院通過原生質體單核化技術雜交得到香菇品種“申香”系列[7－9]。在食用菌研究中，原生質體的制備不僅在育種[10－14]中起著基礎研究作用，同時也為菌種脫毒復壯[15－16]提供了新思路。

目前對秀珍菇原生質體的研究較少且著重在原生質體制備單因素方面[17－18]，本試驗采用多因素正交組合的方法，明確了秀珍菇原生質體的最佳制備條件，并得到秀珍菇原生質體再生最適宜的培養基。以期建立秀珍菇原生質體的高效制備轉化體系，為后續細胞水平的育種工作和其他遺傳研究提供科學依據。

1 材料與試劑

1.1 材料

供試菌株為夏秀，引自江蘇省農業科學院，如圖1。

圖1 秀珍菇菌株夏秀子實體Fig．1 Fruitbody of Pleurotus pulmonarius strain xiaxiu

1.2 試劑試劑

溶壁酶（lywallzyme）[19]，購自廣東省微生物研究所；蝸牛酶（snailase），購自索萊寶（Solaibio） 公司；纖維素酶（cellulase），購自索萊寶（Solarbio）公司。

注射器中放入厚2 cm左右的脫脂棉，高壓滅菌后備用。

1.3 培養基

PDA（馬鈴薯葡萄糖培養基） 培養基：馬鈴薯（去皮） 200 g、葡萄糖 20 g、KH2PO43 g、MgSO41．5 g、瓊脂20g，加水定容至1L。使每平板定量為20mL。

TB3[20－21]再生培養基：酵母提取物3 g、酸水解酪蛋白3 g、蔗糖200 g、葡萄糖10 g、瓊脂8 g，加水定容至1 L。

改良PD培養基：馬鈴薯（去皮） 200 g、葡萄糖 20 g、蛋白胨 5 g、KH2PO43 g、MgSO41．5 g，加水定容至1 L。

2 試驗方法

2.1 酶液配制

以溶壁酶穩滲劑為試劑，配置成濃度（W·V－1）為1%、1．5%、2%、2．5%、3%的酶液，在無菌條件下用0．22 μm的微孔濾膜過濾除菌備用。

2.2 穩滲劑配制

以蔗糖、甘露醇、MgSO4·7H2O、KCl為溶質，配制濃度（n·V－1）為0．6 mol·L－1穩滲劑溶液，高壓滅菌后備用。

2.3 原生質體的制備

首先將菌種母種在斜面培養基（PDA） 上進行活化，25℃培養數天后轉接到改良PD培養基中培養5 d，再將其置于50 mL離心管中6 000 r·min－1～10 000 r·min－1離心 15 min，去掉上清。分別用無菌水清洗1次，穩滲劑清洗2次收集菌絲。按照菌絲濕重（500 mg） 和酶液（1 mL） 的比例添加酶液，然后在25℃下進行水浴酶解2 h。水浴過程中每15分鐘振蕩離心管，待酶解完畢時，吸取少量酶解液用血球計數板在顯微鏡下觀察計數。原生質體如圖2所示。

圖2 秀珍菇菌株夏秀原生質體Fig．2 Protoplast of Pleurotus pulmonarius strain xiaxiu

2.4 原生質體的純化

在離心管中加入5倍～7倍穩滲劑以停止酶解反應。使用含有脫脂棉的注射器過濾除去菌絲，2 000 r·min－1離心15 min去掉酶液。得到的原生質體沉淀用穩滲劑清洗2次，即為純化的原生質體懸浮液。

2.5 復合因素對原生質體制備的影響

采用正交試驗，篩選秀珍菇原生質體制備的最佳條件組合。采用L9(34)正交表進行四因素三水平正交試驗，見表1。

表1 正交試驗因素水平表Tab．1 Factors and levels of orthogonal test

2.6 正交試驗的驗證

通過正交試驗結果（各因素K值大小）得到理論最佳條件并進行驗證。根據理論條件得到的原生質體濃度同正交試驗中得到的直接最佳結果進行差異顯著性試驗。

2.7 原生質體的再生

用穩滲劑將原生質體懸浮液稀釋至原生質體濃度到104數量級。然后將原生質體懸浮液接種到TB3再生培養基上進行培養。

接種再生方式有3種，a直接涂菌法：用移液槍吸取200 μL原生質體懸浮液滴到已冷卻至完全凝固的再生培養基平板上；b單層混菌法：用移液槍吸取200 μL原生質體懸浮液加到冷卻至40℃～45℃的TB3再生培養基中，混勻后倒入滅菌的平板中；c雙層混菌法：用移液槍吸取200 μL原生質體懸浮液加到冷卻至40℃～45℃的TB3再生培養基中，混勻后倒入TB3再生培養基平板中。封口后用手轉動平板至懸浮液均勻布滿平板。

用無菌水代替液體再生培養基，稀釋原生質體懸浮液待原生質體漲破后涂平板作為對照，以消除菌絲片段形成菌落而產生的誤差。每個處理重復5次，放置于25℃恒溫培養箱中培養，待5 d左右菌落數不再增加時進行統計，比較原生質體的再生情況。原生質體再生率（P）的計算公式為：

P（%） =(n1-n2)×100/n

式中：n1表示原生質體再生菌落數；n2表示對照平板中菌落數；n1-n2表示絕對再生菌落數；n表示涂布的原生質體數。

2.8 數據處理

相關數據采用Excel 2010進行整理并進行方差分析，每個處理5次重復。采用Duncan’s新復極差法統計分析。

3 結果與分析

3.1 供試菌株夏秀的栽培特性

如圖1所示，夏秀菌株的菇體較小，菌蓋較厚，菌蓋直徑小于3 cm，菌蓋厚0.4 cm～0.6 cm，灰白色至淺褐色，菌柄長5 cm～6 cm，菌柄粗0.5 cm～1.3 cm，子實體散生。菌絲生長溫度為10℃～35℃，最適宜生長溫度25℃～30℃；子實體生長溫度為10℃～32℃。屬秀珍菇中的中高溫品種，優點突出[22]。

3.2 復合因素對原生質體制備的影響

對菌齡、酶解時間、酶解溫度、穩滲劑種類4個因素進行正交試驗，通過上述單因素試驗得到最佳單因素條件，以之為基礎確定正交試驗的3個水平值，采用L9（34）正交表進行四因素三水平正交試驗。綜合評價如表2所示。

根據K值大小，得到秀珍菇原生質體制備的最佳條件組合為A2B2C3D2，即：菌齡5 d、酶解時間4 h、酶解溫度30℃、0.6 mol·mL-1甘露醇為穩滲劑。

表2 L9(34)正交試驗結果Tab.2 Results of orthogonal test

R值越大，說明因子對所得原生質體的濃度影響越大。極差分析結果表明，4個單因子的影響順序為：D＞C＞A＞B，即穩滲劑種類對秀珍菇原生質體濃度影響最大，酶解溫度、菌齡居次，酶解時間影響最小。

3.3 正交試驗的驗證

L9(34)正交試驗驗證結果見表3。

表3 驗證試驗結果Tab.3 Results of verification test

由表 3 可知，T=127．35，μ=T/9 （14．15），正交試驗中直接最佳結果為試驗7，在A3B1C3D2條件下，可得秀珍菇原生質體濃度為 3．39×107個·mL－1；根據K值可得正交試驗理論最佳條件為A2B2C3D2，根據此條件制備秀珍菇原生質體，其濃度為4．23×107個·mL－1。同時由表3可知，3個數值中正交試驗理論最佳條件所得的數值最大，且與其他二者呈顯著性差異。

3.4 原生質體的再生

原生質體的再生情況見圖2、表4。

圖2 秀珍菇菌株夏秀原生質體的再生Fig．2 Protoplast regeneration of Pleurotus pulmonariusstrain Xiaxiu

表4 不同接種方式對夏秀原生質體再生的影響Tab．4 Effects of different inoculation method on protoplast regeneration of Pleurotus pulmonarius strain Xiaxiu

原生質體的接種方式對原生質體再生率的大小具有一定影響，3種接種方式所得的夏秀原生質體再生率大小為：b＞a＞c，其中采用單層混菌法接種原生質體再生率最大為2．35%。

4 討論

在秀珍菇原生質體制備過程中有多個影響原生質體分離的因素，如果將所涉及的多個因素一一組合進行試驗，工作量過大且效率太低。因此，引入正交試驗方法是十分必要的。

原生質體制備的本質是通過酶解破除細胞壁使原生質體游離出來，因此酶的選擇是至關重要的。在食用菌側耳屬相關介紹中，多采用溶壁酶、纖維素酶、蝸牛酶，或者多種酶混合進行試驗。本試驗中，以上述3種酶作為試驗對象。纖維素酶的效果較差，鏡檢時能看到未充分溶解的方形晶體。而植物原生質體制備時，纖維素酶效果較好[23－24]。筆者推測原因有2個，一是真菌細胞壁的成分復雜，纖維素酶作為單一酶類無法破壁完全，二是纖維素酶的溶解條件和夏秀的酶解條件（如穩滲劑的選擇及濃度）不同且存在一定差距，從而影響了纖維素酶的酶解效果。

本試驗通過最佳制備條件得到的夏秀原生質體最大濃度為 4．23×107個·mL－1，介于萬南安[17]與于清偉[18]所得結果之間。分析具體原因有2個，一是所選取的秀珍菇品種不同，造成得到的結果不同。萬南安和于清偉選取的秀珍菇品種同本試驗的試驗對象夏秀為不同品種，品種的差異造成菌絲原生質體制備時具體濃度和影響條件不同。但各因素的總體趨勢基本一致。所得的原生質體濃度隨著酶濃度的升高、酶解時間的延長呈現先上升后下降的趨勢。這進一步啟示我們，是否不同品種的秀珍菇或其他種類食用菌，都會呈現不同的生物學特性和不同的原生質體制備條件。那么原生質體的制備是否和其自身的生物學特性具有某種相關性。二是前兩者都是只進行了單因素試驗且都采用多因素逐項試驗設計，即將前一步得到的單因素A最優值代入后一步單因素試驗B中。而前一步單因素最優值的結果影響下一步單因素試驗的結果，即單因素試驗順序的選擇影響最終試驗結果，進一步證明正交試驗的必要性。

原生質體的再生接種方式是影響原生質體再生率的重要因素[25]，本試驗采用單層混菌法將原生質體懸浮液接種到TB3培養基中所得的再生率為2．35%，明顯高于其他作者關于秀珍菇原生質體再生率0．85%的試驗結果[17，26]，具體分析原因，一是接種方式的選擇，單層混菌法的接種方式優勢明顯，其結果高于直接涂菌法和雙層混菌法。二是接種后個人操作方法，接種后大多選擇用涂布棒進行涂布，而涂布棒會對原生質體造成機械損傷，使原生質體破裂，本試驗在接種封口后，用手輕輕轉動平板，使原生質體分布均勻，避免損傷。三是再生培養基的選擇，筆者在預試驗中選用PDA、TB3、MYG（麥芽糖酵母膏）再生培養基，發現TB3的再生率高出其他2種。

無機鹽、糖類和糖醇都是秀珍菇原生質體制備時適宜的滲透壓穩定劑，不同穩滲劑對原生質體制備、再生有很大的影響。本試驗中，有機類溶液作為穩滲劑效果優于無機穩滲劑。與何小慧[27]、王金斌等[28]的試驗結果相同。

5 結論

原生質體的分離和再生是兩個相互聯系的過程，原生質體的制備濃度和再生率的大小是影響后續原生質體轉化試驗的重要因素[29－30]，而本試驗通過單因素和正交試驗相結合的方法，確定了秀珍菇原生質體制備的最佳條件為：秀珍菇菌絲在改良液體PD培養基中搖瓶培養 5 d，以 0．6 mol·mL－1甘露醇為穩滲劑，2．5%溶壁酶按酶液和菌絲（濕重）為2∶1的體積質量比混合在30℃條件下水浴4 h，所得原生質體濃度最大，濃度為 4．23×107個·mL－1。各因素的影響順序為穩滲劑種類＞酶解溫度＞菌齡＞酶解時間。通過單層混菌法接種原生質體于TB3再生培養基，再生率最高，為2．35%。