阿奇霉素片含量的HPLC法測定

吳青一 瞿燕萍 周旭如

摘 要 目的：對建立的阿奇霉素片含量測定的高效液相色譜法進行方法驗證。方法：色譜柱為Waters XBridge C18（4.6 mm×75 mm， 5 μm），流動相為磷酸鹽緩沖液-甲醇-乙腈（8∶3∶9），檢測波長210 nm，流速1.5 ml/min，柱溫50 ℃，進樣體積50 ml。結果：該方法的專屬性、系統適用性、重復性、中間精密度、溶液穩定性、耐用性均符合驗證可接受標準，阿奇霉素在149. 47～348.77 mg/ml范圍內線性關系良好，相關系數r=0.999 99，平均加樣回收率為100.7%，RSD為0.68%（n=9）。結論：該方法準確可靠，適用于阿奇霉素片含量的定量分析。

關鍵詞 高效液相色譜法 阿奇霉素片 含量

中圖分類號：R927.2 文獻標志碼：A 文章編號：1006-1533（2018）17-0076-04

Determination of the content of azithromycin tablets by HPLC

WU Qingyi*， QU Yanping， ZHOU Xuru

（Shanghai Shyndec Pharmaceutical Co.， Ltd.， Shanghai 200137， China）

ABSTRACT Objective： To validate the method for determination of the content of azithromycin tablets by HPLC. Methods： HPLC was carried out on a Waters XBridge C18 column （4.6 mm×75 mm， 5 μm） with a mixture of phosphate buffermethanol-acetonitrile （8：3：9） as the mobile phase at the detection wavelength of 210 nm， the flow velocity of 1.5 ml/min and the column temperature of 50 ℃ with sample volume of 50 μl. Results： The specificity， system applicability， repeatability， intermediate precision， stability of the solution and durability of this method could meet the criteria for validation， the standard curve of azithromycin showed good linearity in the range of 149.47-348.77 mg/ml with the correlation coefficient （r） of 0.999 99. The average recovery of samples was 100.7% with RSD of 0.68% （n=9）. Conclusion： This method is accurate and reliable and suitable for quantitative assay of azithromycin tablets.

KEy WORDS HPLC； azithromycin tablets； assay

阿奇霉素（azithromycin）是第一個十五元環大環內酯類抗生素，也是第一個氮雜內酯類抗生素，相比紅霉素，其最大的特點是對酸穩定。本品臨床給藥次數少，療程短，被認為是一個很有效的大環內酯類抗生素，臨床應用廣泛，尤其適合于混合感染的治療[1]。其制劑阿奇霉素片被列為國家基本藥物，具有廣泛的市場。本公司為了提高產品質量，對其處方及工藝進行了改進。為了保證分析檢測結果準確、可靠，可有效地控制藥品的內在質量，必須對所采用的分析方法進行驗證。依據《中國藥典》藥品質量標準分析方法驗證指導原則及《藥品GMP指南》要求[2-3]，本研究對阿奇霉素片含量測定的HPLC法進行驗證，并對每個驗證參數設立了可接受標準。通過方法驗證，確定該方法可以在本實驗室用于阿奇霉素片含量的定量分析，確保檢驗結果的準確性。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Waters e2695高效液相色譜儀（美國Waters公司）；XS205電子分析天平（瑞士Mettler公司）；DL-800B智能超聲清洗器（上海之信儀器有限公司）；L600型臺式低速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；阿奇霉素對照品（批號：130593-201301，含量：94.4%，中國食品藥品檢定研究院）；阿奇霉素原料藥（批號：AIF-1609001，含量：94.34%，上海現代制藥股份有限公司海門基地）；磷酸氫二鉀、1-辛烷磺酸鈉、磷酸二氫銨（HPLC純，Alfa Aesar公司）；甲醇、乙腈（HPLC純，美國默克公司）；磷酸（HPLC純，美國TEDIA公司）；氨水（分析純，上海凌峰化學試劑有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制

1）稀釋液 磷酸二氫銨溶液（稱取磷酸二氫銨1.73 g，加水1 000 ml溶解，用氨水調節pH至10.0±0.05）-甲醇-乙腈（7∶7∶6）。

2）對照品溶液 精密稱取阿奇霉素對照品約26.2 mg，置于100 ml量瓶中，加稀釋液適量使其溶解，再用稀釋液定容，搖勻，作為對照品溶液。

3）供試品溶液 取本品20片，研磨成細粉，精密稱取細粉約92 mg（約含阿奇霉素50 mg），置200 ml量瓶中，加入稀釋液約150 ml，超聲15 min，冷卻至室溫后加入稀釋液定容，搖勻。取溶液適量，以6 000 r/min離心10 min，取上清液作為供試品溶液。

4）空白全輔料溶液 精密稱取空白全輔料約39.6 mg，置200 ml量瓶中，余同供試品溶液操作，取上清液作為空白全輔料溶液。

5）線性測試溶液 精密稱取阿奇霉素對照品約26.2 mg，置于50 ml量瓶中，加稀釋液適量使其溶解，再用稀釋液定容，搖勻，作為對照品貯備液。分別精密量取該溶液3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 ml置10 ml量瓶中，用稀釋液稀釋至刻度，搖勻，作為不同濃度的線性測試溶液。

6）回收率測試溶液 精密稱取空白全輔料3份各39.6 mg，分別與阿奇霉素41.9、52.4、62.9 mg一起置于3個200 ml量瓶中，余同供試品溶液操作，配制成80%、100%和120%的回收率測試溶液各3份。

1.2.2 色譜條件

色譜柱為Waters XBridge C18柱（4.6 mm×75 mm，5μm），流動相為磷酸鹽緩沖液（4.4 g磷酸氫二鉀和0.5 g 1-辛烷磺酸鈉溶解于1 000 ml水中，用磷酸調節pH至8.2）-甲醇-乙腈（8∶3∶9），檢測波長210 nm，流速1.5 ml/min，柱溫50 ℃，進樣體積50 ml，進樣時間：15 min。

2 結果

2.1 專屬性試驗

分別精密吸取空白溶劑（稀釋液）、空白全輔料溶液、對照品溶液各50 ml，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結果表明空白溶劑（稀釋液）、空白全輔料溶液在阿奇霉素峰位置無雜質峰（圖1中保留時間6.506 min），對阿奇霉素含量測定無干擾。

2.2 系統適用性試驗

5次連續進樣測定的主峰面積RSD為0.49%（應≤1.5%），對照品溶液主峰理論板數為4 574（應≥1 000），拖尾因子為1.42（應≤2.0）（表1）。結果表明系統重復性良好，系統適用性符合規定。

2.3 線性關系試驗

以線性溶液濃度C為橫坐標、阿奇霉素峰面積A為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程A=3 220 442C+844，r=0.999 99，表明該方法在149.47～348.77 mg/ml濃度范圍內，線性關系良好（表2）。

2.4 準確度試驗（含量測定中加樣回收率的檢測）

取3種不同濃度的回收率測試溶液分別進樣測試，每個濃度樣品進行3次平行測試。回收率按外標法以峰面積的平均值計算。結果表明，平均回收率為100.7%（應為98.0%～102.0%），RSD為0.68%（應≤2.0%），均符合規定（表3）。

2.5 重復性試驗

取阿奇霉素片171107批，按含量測定方法，配制6份供試品溶液進行檢測，6份平行樣的含量分別為100.98%、100.78%、99.34%、99.69%、99.84%、99.41%，平均含量為100.01%，RSD為0.71%（應≤2.0%），符合規定。

2.6 中間精密度試驗

取阿奇霉素片171107批，由不同人在不同日期及不同儀器按含量測定方法進行檢測，即2人各做3份，6次數據分別為99.69%、99.84%、99.41%、98.88%、98.19%、98.96%，平均含量為99.16%，RSD為0.62%（應≤2.0%），符合規定。

2.7 溶液的穩定性試驗

對照品溶液和供試品溶液于室溫放置0、4、8、12、16、20、24 h時分別進樣測試，結果表明：對照品溶液和供試品溶液于室溫下放置20 h內穩定，其主峰面積的RSD分別為0.50%，0.88%（應≤1.5%），符合規定。

2.8 耐用性

平行制備供試品溶液2份，每份進樣2次，分別考察預定不同的有機相比例的流動相（①甲醇比例不動，鹽相和乙腈比例±5%；②鹽相比例不動，甲醇和乙腈比例±5%）、波長±2 nm、柱溫±5 ℃、流速±0.2 ml/min條件下的系統適用性及含量。實驗結果表明各條件波動范圍內，對照品溶液主峰的理論板數均≥1 000、拖尾因子均≤2.0，符合要求；各條件下含量（n=6）的RSD均<1.5%（應≤1.5%）。試驗結果表明，本方法的耐用性良好。

2.9 樣品檢測

取三批阿奇霉素片，按本法進行含量檢測，結果分別為100.88%、98.92%、98.89%（應為90.0%～110.0%），均符合規定。

3 討論

《中國藥典》2005年版采用抗生素微生物檢定法進行阿奇霉素的含量分析，盡管該法能真實體現該藥品的抗菌活性，但檢驗周期較長、操作較繁瑣。而HPLC法專屬性強，靈敏度高，準確度和重復性好，省時方便，是阿奇霉素含量測定的有效手段[4-5]。

《中國藥典》2015年版的含量檢測方法[6]，需要進系統適用性溶液，且應與標準系統適用性圖譜一致，故使用250 mm長柱，主峰出峰時間約為30 min，流動相配制過程對pH的要求較高。

潘強[4]、韓正爽等[5]的含量測定方法選用250 mm長柱，流動相組分中無甲醇，流速較低，以致檢測時間延長，工作效率偏低。

本研究建立的方法參照美國藥典方法[7-8]，選用75 mm長的短柱，使得主峰出峰時間提早到6～7 min，考慮空白輔料的影響，每針檢測時間只需15 min，大大縮短檢測時間，提高工作效率；且不需使用系統適用性對照品，系統適用性試驗阿奇霉素對照品溶液主峰理論板數（應≥1 000），拖尾因子（應≤2.0）符合規定即可。含量測定的色譜條件與溶出度的一致，使得檢驗過程更加便捷。故該方法簡便、快速，能有效地降低分析成本，減小實驗室污染。并且本法用離心的方法獲得供試品溶液，杜絕了使用過濾器帶來的不利影響。同時，在檢測中減少了不必要的稀釋步驟，嚴格控制實驗條件，在濕度符合要求的情況下，稱量過程中由一人操作，避免多人操作帶來的人為誤差。因標準溶液的配制過程對阿奇霉素含量測定準確度的影響較大[9]，故本法可以通過加大對照品稱樣量，來減少不確定度對結果的影響，從而更好地控制藥物分析的測量結果。

參考文獻

[1] 商鼎. 阿奇霉素片的溶出度研究[J]. 上海醫藥， 2017， 38（13）： 63-66.

[2] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典（2015年版）四部[M]. 北京： 中國醫藥科技出版社， 2015： 374-377.

[3] 國家食品藥品監督管理局藥品認證管理中心. 藥品GMP指南： 質量控制實驗室與物料系統[M]. 北京： 中國醫藥科技出版社， 2011： 129-143.

[4] 潘強. HPLC法測定阿奇霉素片的含量[J]. 中國藥品標準， 2009， 10（4）： 301-303.

[5] 韓振爽， 李瑋瑋. 高效液相色譜法測定阿奇霉素片中阿奇霉素含量[J]. 天津藥學， 2013， 25（1）： 15-16.

[6] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典 （2015年版） 二部[M]. 北京： 中國醫藥科技出版社， 2015： 561-561.

[7] The United States Pharmacopeia Convention. Azithromycin tablets[EB/OL]. [2018-03-22]. http：//www.drugfuture.com/ Pharmacopoeia/usp36/PDF/1264-1266.pdf.

[8] The United States Pharmacopeia Convention. Azithromycin tablets[EB/OL]. [2018-03-22]. http：// www.drugfuture.com/Pharmacopoeia/USP40/download. aspx？filename=850Azithromycin%20Tablets.

[9] 張竹. 高效液相色譜法測定阿奇霉素片含量的不確定度分析[J]. 中國藥物經濟學， 2016， 11（12）： 22-25.