植物組織培養中褐變的發生機制與防治方法

劉悅

摘 要 褐變是植物組織培養中的普遍存在的現象，已經成為影響組織培養成功的重要因素，并且已成為組織培養中的一大難題。本文揭示了褐變的發生機制及控制機理、影響褐變的因素，并于此提出了防治褐變的措施，以期為解決褐變問題提供理論依據。

關鍵詞 植物組織 褐變 機制 防治

中圖分類號：Q943.1 文獻標識碼：A

褐變在植物組織培養過程中普遍存在，國內學者普遍認為褐變能否得到有效控制是植物組織培養能否成功的關鍵所在，并且證明了褐變度與總酚含量以及PPO活性之間的關系因品種而異。而國外學者Mayer和Harel則注意到正常果實組織中雖然存在有酚類物質和PPO，卻并不發生褐變，指出果實中酚類物質和PPO在細胞中可能是區域化狀態分布。

1褐變的發生機制

關于褐變的發生機制，目前認為褐變分為兩種：即酶促褐變和非酶促褐變。但諸多研究認為引起褐變發生的主要是酶促褐變。醌類化合物在酪氨酸酶的作用下與培養材料組織中的蛋白質發生聚合，引起其他酶系統失活，導致代謝紊亂，生長受阻。當細胞膜的結構發生變化和破壞時，則為底物創造了與PPO接觸的條件，在氧存在的情況下使酚類物質氧化成醌，再進行一系列的脫水、聚合反應，最后形成黑褐色物質，從而才引起褐變。

2影響褐變的因素

不同的材料、環境條件、因素或操作手段都會嚴重影響褐變發生的程度，不同的褐變程度也跟實驗結果、研究目的息息相關。在外植物體材料的基因型與生理狀態確定的情況下，外植物體的種類和大小、培養條件是影響褐變的主要因素。

2.1外植體的種類和大小

一般認為，木本植物比草本植物的外植體在培養中更易發生褐變。外植體小的材料，因為切口所占比例較大而較易發生褐變。切口越大，酚類被氧化的面積就越大，褐變現象越嚴重。

2.2培養條件

培養室的溫度控制在15℃～20℃，可有效地防止褐變的發生。高溫一方面不利于傷口的愈合，另一方面會增強多酚氧化酶的生物活性，從而加速氧化過程，使植物材料的褐變更為嚴重。其次，光照強度也能影響褐變的發生及褐化程度。在黑暗條件下外植體褐變嚴重，在光照條件下外植體褐變發生晚、程度輕，光照強度增加外植體褐變嚴重。

3防治褐變的方法

3.1選擇適宜的外植體和培養條件

取材時，需要注意除時間以及采光等外，還應注意外植體的基因型及部位，選擇褐變程度較小的品種和部位作外植體。同時，適當改變培養基的狀態、硬度、pH值、縮短轉接周期等方法也可減輕褐變的毒害。在一定范圍內，瓊脂用量大，培養基硬度大。褐變率低。在水稻體細胞培養中，pH值為4.5～5.0時MS培養基可保持愈傷組織處于良好的生長狀態，其表面呈黃白色，而pH值為5.5 ～ 6.0時愈傷組織嚴重褐變。在外植體接種后1-2 d即轉移至新鮮培養基中或同一培養基的不同部位，可以防止酚類物質在傷口周圍積累過多，連續轉移幾次即可防止褐變。

3.2使用抗褐變劑和吸附劑

在組培時，在培養基中加入抗氧化劑、增效劑或使用抗氧化劑和增效劑對材料預處理，可抑制外植體的酶促褐變。在植物組培中用于抑制褐化常用的抗氧化劑有：抗壞血酸（Vitamin C）、硫代硫酸鈉（Na2S2O3）。此外還有檸檬酸、L-半胱氨酸（L-Cys）、谷胱甘肽、蕓香苷、二硫蘇糖醇等。VC和檸檬酸主要在早期起作用，隨培養時間的延長作用逐漸消退，亞硫酸鈉在中后期作用較好，但對植物具有一定毒害作用，不宜單獨添加。抗氧化劑對外植體的培養會起到一定的副作用，培養基添加濃度不宜過高，一般在200mg/L以下，且多用于初期培養而不宜長期培養，還原性抗氧化劑在使用時應注意保持其還原性，一般最好過濾除菌使用，不要與培養基一起高溫滅菌。

綜上所述，褐變發生的機理在于醌類化合物與蛋白質發生聚合，引起其他酶系統失活，進而導致植物生長緩慢，甚至死亡。而外植體材料基因型與其外在形態，和材料、環境、操作等諸多因素影響其褐變的發生。因此，擇適宜的外植體和培養條件，或者使用抗褐變劑和吸附劑，可以遏制褐變的發生。如今，組培技術已大量應用于花卉生產、農作物栽培以及特種經濟植物的幼苗、脫毒苗，使作物種植逐步走向集中控制化、規模化、自動化。但在試驗和生產過程中也經常會出現外植體褐變、污染和玻璃化現象這三大難。因而，如何防治褐變的產生和加強外植體褐變方面的研究顯得尤重要。

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