黃芪多糖對血管平滑肌細胞增殖的抑制作用研究

石軍飛 劉 娟 閆 超 金殿生

（1 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院 藥劑科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010030；2 內(nèi)蒙古自治區(qū)第四醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000；3 呼和浩特市第一醫(yī)院 超聲科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000）

血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）是指存在于血管壁且組成其主要部分的特定類型細胞，維持血管張力的主要細胞成分，其結(jié)構(gòu)及功能的改變是導致高血壓、動脈粥樣硬化和血管成形術(shù)后再狹窄等多種心血管病的細胞病理學基礎(chǔ)。許多研究表明，VSMCs的異常增殖和凋亡是導致心腦血管疾病的主要因素[1]。黃芪多糖是豆科植物黃芪（Astragalus membranaceus （Fisch.） Bunge.）的干燥根經(jīng)提取而成的水溶性多糖，黃芪多糖是黃芪發(fā)揮作用的主要成分。黃芪作為常用中草藥，具有益氣固表、斂汗固脫、托瘡生肌、利水消腫之功效。其主要含有皂苷類、多糖類、黃酮類、氨基酸及各種微量元素等成分。但其主要成分為黃芪多糖，含量高達50%以上，極具藥用價值。黃芪多糖可作為免疫促進劑或調(diào)節(jié)劑，同時具有抗病毒、抗腫瘤、抗衰老、抗氧化應激等作用[2-3]。本文擬通過建立大鼠實驗模型，探討黃芪多糖在VSMCs增殖過程中的抑制作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料：雄性SD大鼠，體質(zhì)量200～220 g，購自中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所，合格證號SCXK（京）2016-0008，恒溫（22～25 ℃）、恒濕（55±5）%飼養(yǎng)，所用食物和水均滅菌處理。黃芪多糖購自中國食品藥品檢定研究院。

1.2 大鼠VSMCs的培養(yǎng)與分組：采用5%水合氯醛麻醉大鼠，在無菌操作臺上迅速分離取出大鼠胸主動脈，置于4 ℃的無菌DMEM溶液中。PBS液反復沖洗血管，用消毒棉簽插入血管腔內(nèi)來回抽插去除內(nèi)皮細胞，再用眼科鑷剝除血管外膜。剪開血管，再用PBS液沖洗3次，用手術(shù)剪將血管剪成1 mm2左右的組織塊，將組織塊移入培養(yǎng)瓶，向含DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶內(nèi)加入10%胎牛血清，37 ℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育72 h，每24 h換液1次。觀察細胞生長狀態(tài)，待細胞融合達80%以上時，棄去舊培養(yǎng)液，用PBS液沖洗細胞3次，繼續(xù)進行傳代培養(yǎng)。本實驗采用第5～7代VSMCs細胞。將培養(yǎng)至第5～7代的VSMCs分為四組：對照組和黃芪多糖30、60、90 mg/L劑量組。

1.3 3H-TdR摻入率實驗：將VSMCs接種于96孔培養(yǎng)板上（1×106/L），培養(yǎng)48 h后換新鮮培養(yǎng)液，待細胞生長至90%融合時，棄去培養(yǎng)液，換用DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)饑餓培養(yǎng)24 h。對照組每孔加入10% FBS，黃芪多糖組每組分別加入黃芪多糖溶液30、60、90 mg/L，同時加入10% FBS。48 h后，對照組和黃芪多糖組均加入3H-TdR（3.0×105Bq/L），繼續(xù)孵育48 h。采用β-液體閃爍儀測定VSMCs的CPM（count per minute）值。

1.4 MTT法檢測VSMCs增殖：取第5～7代VSMCs加入0.5%胰蛋白酶消化，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基配成細胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板上（1×106/L），培養(yǎng)48 h后換新鮮培養(yǎng)液，待細胞生長至80%融合時，棄去培養(yǎng)液，換用DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。對照組每孔加入10% FBS，黃芪多糖干預組分別加入黃芪多糖溶液30、60、90 mg/L，同時加入10% FBS。每組設(shè)5個復孔、2個不加細胞的空白對照孔。將細胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育分別培養(yǎng)12、24、48 h。每孔加入MTT液30 μL，繼續(xù)置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育8 h，棄去上清液，加入100 μL DMSO，震蕩5 min。采用酶標儀于490 nm波長處測定各孔吸光度值。

1.5 統(tǒng)計學處理：采用SPSS 13.0數(shù)理統(tǒng)計分析軟件處理實驗數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以（±s）表示，用t檢驗比較組間差異的顯著性，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 黃芪多糖對VSMCs DNA合成的影響：3H-TdR摻入率實驗結(jié)果顯示，對照組VSMCs的3H-TdR摻入量最高，而黃芪多糖干預組與對照組相比較3H-TdR摻入量明顯下降（P＜0.01），具有統(tǒng)計學意義。且隨著黃芪多糖給藥濃度增加，3H-TdR摻入量呈下降趨勢。表明黃芪多糖可抑制VSMCs DNA合成，進而抑制VSMCs的過度增殖，見表1。

表1 黃芪多糖對VSMCs DNA合成的影響（±s）

表1 黃芪多糖對VSMCs DNA合成的影響（±s）

注：與對照組相比較，*P＜0.01

組別 3H-TdR CPM值對照組 9518.36±491.58黃芪多糖30 mg/L 7565.30±430.26*黃芪多糖60 mg/L 4913.29±391.54*黃芪多糖90 mg/L 3536.85±428.27*

2.2 VSMCs增殖測定結(jié)果：與對照組相同時間吸光度值相比較，黃芪多糖干預組（30、60、90mg/L）吸光度均顯著下降，且黃芪多糖低劑量組48 h與對照組比較具有顯著性差異（P＜0.05），黃芪多糖中、高劑量組12 h、24 h、48 h與對照組比較軍具有顯著性差異（P＜0.05），具有統(tǒng)計學意義。且隨著黃芪多糖濃度的增加，同一時間測得的吸光度值降低呈下降趨勢。說明黃芪多糖對大鼠VSMCs具有抑制作用，且隨著黃芪多糖劑量的增加，抑制作用也逐步增強，見表2。

表2 VSMCs吸光度值測定結(jié)果（±s）

表2 VSMCs吸光度值測定結(jié)果（±s）

組別 吸光度值(OD值)12 h 24 h 48 h對照組 0.416±0.003 0.581±0.007 0.925±0.005黃芪多糖30 mg/L 0.367±0.005 0.512±0.004 0.638±0.006黃芪多糖60 mg/L 0.304±0.002 0.425±0.008 0.522±0.005黃芪多糖90 mg/L 0.261±0.004 0.336±0.002 0.415±0.003

3 討 論

血管壁由內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞構(gòu)成，血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞的相互作用是促進血管形成的主要因素，也影響著血管正常生理功能的發(fā)揮。VSMCs根據(jù)其功能和形態(tài)分為收縮型和合成型，在生理狀態(tài)下，VSMCs主要以收縮型來維持正常的血管張力，病理狀態(tài)下，VSMCs主要以分泌型為主導，并具有更強大的增殖和遷移活性[4]。當血管中膜的VSMCs由收縮型轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣尚蜁r，開始遷移至血管內(nèi)膜并大量增殖，此為血管損傷后的一種自身修復響應，也是血管再狹窄形成的主要病理過程之一[5-6]。因此，通過抑制VSMCs的異常增殖和遷移是預防血管再狹窄的主要途徑。

黃芪多糖是從黃芪中采用傳統(tǒng)的水提醇沉工藝提取而來，是黃芪中的主要活性成分。研究表明，黃芪多糖具有多種藥理作用。Han等研究證實，黃芪多糖可提高實驗大鼠機體的抗氧化能力，減輕由高脂飲食導致的氧化損傷[7]。另有報道，黃芪多糖能通過改變細胞內(nèi)信號分子，進而影響淋巴細胞信號傳導，達到調(diào)節(jié)免疫功能的作用。黃芪多糖還可顯著提高血清超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶的活性[8]。黃芪多糖作用于細胞膜的TLR4、CR3等受體，引起炎性因子釋放，誘導Th1、Th2發(fā)生免疫反應，進而可提高巨噬細胞吞噬功能，誘導一氧化氮的體內(nèi)合成[9]。

VSMCs在正常生理條件下，主要起到調(diào)節(jié)血管壁張力，分泌釋放各種血管調(diào)節(jié)因子和維持血管正常生理功能的作用。但當血管內(nèi)皮環(huán)境受到損傷后，會釋放一些炎性細胞因子，這類細胞因子可激活細胞內(nèi)信號傳導通路，促進VSMCs增殖[10]。而VSMCs的異常增殖和遷移是導致各種心血管疾病的病理基礎(chǔ)。本實驗研究表明，黃芪多糖可有效抑制FBS誘導的VSMCs過度增殖，且隨濃度增加，抑制作用也逐漸增強，從而可起到抑制血管腔狹窄的作用。

本研究證實黃芪多糖具有抑制VSMCs過度增殖的作用，可有效預防血管腔狹窄發(fā)生。鑒于血管內(nèi)皮細胞損傷是動脈粥樣硬化性病變的關(guān)鍵機制和干預靶點，因此，我們將會進一步通過建立實驗模型闡明其作用機制。黃芪多糖也有望為動脈粥樣硬化性疾病的防治提供新的防治途徑。