HPLC法測定益宮顆粒中阿魏酸的含量

高松紅 單柏宇 徐 陽 孫 瑩*

（1 長春醫學高等專科學校，吉林 長春 130031；2 白城市食品藥品檢驗所，吉林 白城 137000）

益宮顆粒是由黃芪、當歸、續斷、益母草、丹參、黨參、香附、敗醬草八味中藥組成，具有溫經止痛和活血化瘀的功效，對于生產后的虛弱受寒所致的小腹疼痛和惡露不絕等癥具有良好療效[1-3]。處方中的黃芪與當歸配伍，可以補益氣血、培補元氣、調和營衛，養氣以生血、治從補氣以行血，平衡機體內的陰陽。續斷則具有強經補腎之功效，可促進津液和血液歸于腎經，攝而防止外漏[1-3]。黨參能夠調節脾胃、健運脾氣、補血益氣。益母草與丹參配合使用具有祛瘀生新的藥效。敗醬草具有排出淤血和去除濁氣的作用。香附具有行氣化血和舒肝養肝的作用。

通過大量的臨床研究表明，益宮顆粒可作為治療產后出血多，惡露時間長的首選藥，但是針對此藥的質量標準研究卻不健全[4-8]。阿魏酸是君藥當歸的主要活性成分，也是《中國藥典》中含量測定的指標性成分。通過研究發現阿魏酸及衍生物具有多方面藥理作用和生物活性，能清除自由基，促進清除自由基的酶的產生，增加谷胱甘肽轉硫酶和醌還原酶的活性，并抑制酪氨酸酶活性，來調節人體生理功能[11-14]。阿魏酸可以抗血小板聚集，抑制血小板5-羥色胺釋放和血小板血栓素A2（TXA2）的生成，同時可增加前列腺素活性，可鎮痛，并可以緩解血管痙攣等[15]。是治療白細胞減少和心腦血管疾病等癥藥品的基本原料，且毒性較低，在醫藥、保健品、化妝品原料和食品添加劑等方面有著廣泛的用途。建立HPLC法測定其在益宮顆粒中的含量，為進一步質量標準的建立奠定基礎。見圖1。

1 材 料

圖1 阿魏酸結構

SHIMADZU LC-2030型高效液相色譜儀（日本島津儀器設備有限公司）；RE 52-99旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；AUW-120D型電子天平（日本島津儀器設備有限公司）；KQ-250型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

阿魏酸（中國藥品食品檢定研究院，批號：110773-200611）；乙腈（色譜純，賽默飛世爾科技（中國）有限公司）；水（純凈水，杭州娃哈哈集團有限公司）；磷酸、無水乙醇（均為分析純，北京化工廠）。

益宮顆粒（陜西健民制藥有限公司，批號見表2）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適應性試驗：色譜柱：Diamonsil C18 （4.6 nm×250 nm，5 μm）；流動相：乙腈-0.1%磷酸水溶液（20∶80，V/V）；體積流速：1.0 mL/min；檢測波長為360 nm；柱溫：35 ℃；進樣量均為10 μL。理論塔板數按阿魏酸計算不低于3000，在此條件下，阿魏酸與其他物質分離度均＞1.5，符合藥典規定，空白色譜圖無干擾，供試品中阿魏酸色譜峰通過HPLC-DAD檢測器測定，色譜峰純度＞990，專屬性良好。結果見圖2、3、4。

2.2 對照品溶液的配制：精密稱約5 mg阿魏酸對照品，置于100 mL容量瓶中，適量甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，精密吸取0.2～10 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，制備成1 mL約含阿魏酸0.01 mg的對照品溶液。

圖2 空白色譜圖

圖3 阿魏酸對照品色譜圖

圖4 益宮顆粒供試品色譜圖

2.3 供試品溶液的配制：取益宮顆粒，粉碎，精密稱定5 g，加20 mL的無水乙醇超聲提取30 min，過濾，收集濾液，重復提取3次，合并濾液，于60 ℃旋轉蒸干，用甲醇溶解并轉移置10 mL量瓶中，定容至刻度，即得。

2.4 線性關系考察：精密稱取25.75 mg阿魏酸對照品，置于100 mL量瓶中，適量甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，分別吸取2、1、0.5、0.25、0.2、0.1 mL，置于10 mL量瓶中，適量甲醇溶解并定容至刻度，搖勻。即濃度為0.05150 mg/mL、0.02575 mg/mL、0.012875 mg/mL、0.0064375 mg/mL、0.00515 mg/mL、0.00258 mg/mL的線性關系對照品溶液。按照“2.1”項下方法，將各濃度線性關系對照品分別注入高效液相色譜儀中，記錄色譜峰的峰面積。以色譜峰面積為Y軸，溶液濃度為X軸作圖，得到阿魏酸的回歸方程為Y=26352X+10.3823，r=0.9998（n=6），表明阿魏酸在0.00258～0.05150 mg/mL范圍內線性關系良好。

2.5 精密度試驗：按照“2.1”項下方法，分別精密吸取對照品溶液和益宮顆粒供試品溶液（批號：201606308）各10μL，分別連續6次注入高效液相色譜儀中，記錄色譜峰的峰面積，結果阿魏酸對照品和益宮顆粒供試品色譜峰面積的RSD值分別為0.98%和1.62%，結果表明此方法具有良好的精密度。

2.6 穩定性考察：分別在0、2、4、6、8、10、12、24 h時，按照“2.1”項下方法分別精密吸取對照品溶液和益宮顆粒供試品溶液（批號為：201606308）10 μL，依次進入高效液相色譜儀中，記錄色譜峰面積，結果阿魏酸對照品和益宮顆粒供試品色譜峰面積的RSD值分別為0.47%和1.68%（n=8），結果表明供試品溶液中阿魏酸在24 h內具有良好的穩定性。

2.7 重復性實驗：精密稱取益宮顆粒（批號：201606308）6份，每份約10 g，按“2.3”項下制備供試品溶液，測定阿魏酸色譜峰面積，并進行含量測定，結果其含量的RSD值為1.84%，結果表明此方法具有良好的重復性。

2.8 加樣回收率實驗：精密稱取阿魏酸對照品6份，每份約15 mg，至100 mL容量瓶中，適量甲醇溶解，并定容至刻度，搖勻，精密吸取0.5 mL，分別加入6份約2.5 g的益宮顆粒（批號：201606308）中，按照“2.3”項下供試品溶液制備方法進行制備，并對其含量進行測定，計算阿魏酸回收率。結果其平均回收率為100.47%，RSD值為0.70%（n=6），表明此方法具有良好的回收率。結果見表1。

表1 加樣回收率測定結果

2.9 樣品測定：選取3批益宮顆粒，按照“2.3”和“2.2”項下方法對供試品溶液和對照品溶液進行制備，分別注入液相色譜儀10 μL，按照外標法對不同批次的供試品中阿魏酸的含量進行計算，結果見表2。

表2 益宮顆粒中阿魏酸的含量測定結果

3 討 論

通過對比熱回流提取法、超聲提取法、索氏提取法和浸漬法等提取方法配合石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇和無水乙醇等試劑進行提取[16-18]，最終確定以無水乙醇為提取溶劑，采用超聲提取法進行提取，此提取方法可以快速、準確的將阿魏酸從益宮顆粒中提取出來。

在色譜條件篩選上，本實驗選取360 nm波長進行測定，在此波長下阿魏酸具有良好的吸收，且在益宮顆粒供試品中，具有良好的分離度，符合藥典規定。本實驗通過對比乙腈-水（或磷酸水）、甲醇-水（或磷酸水）、乙腈-甲醇-水（或磷酸水），最終確定乙腈-0.1%磷酸水溶液（20∶80，V/V）為最佳的色譜條件，阿魏酸在酸性流動相中具有更好的峰型和分離效果。本實驗對不同色譜柱溫度進行考察，發現較高的溫度對阿魏酸的分離效果具有較好的作用，但較高的色譜柱溫度會影響色譜柱的使用時間，最終確定35 ℃為最佳的色譜柱溫度。

益宮顆粒具有良好的藥效作用，且被廣泛應用，但并無一種HPLC相關的質量控制方法。阿魏酸具有良好的藥效作用，在多方面具有良好的藥效作用，是益宮顆粒中君藥當歸中的主要藥效成分，往往以阿魏酸的含量來評價當歸的質量，故本實驗建立一種測定益宮顆粒中阿魏酸含量的方法，從而評價益宮顆粒的質量，為其質量控制奠定研究基礎。