富血小板血漿復合物促進大鼠牙周骨再生的研究

高云飛

（上海天佑醫院口腔科，上海 200331）

牙周病是一種由多種病原微生物引起的感染性炎癥性疾病，其主要特點是牙周支持組織的喪失和牙槽骨的吸收[1]。牙周治療的最終目標在于從三維角度來修復完整的有功能性的牙周附著，使其能夠恢復形成疾病之前的正常結構。自從1993年Langer等學者提出組織工程用于牙周組織再生這一概念之后[2]，牙周再生領域出現了很多新的技術。這一領域的研究主要基于天然或合成型支架材料，細胞，以及生長因子等的聯合應用[3]。

磷酸鈣骨水泥（calcium phosphate cement，CPC）具有高度的生物相容性和骨傳導性，能夠逐漸被新生骨質所替代，已作為骨再生的支架廣泛用于牙周缺損的修復[4]。富血小板血漿（platelet-rich plasma, PRP）作為一種通過自體全血離心去除血紅細胞后，得到的富含血小板的血漿蛋白的濃縮物[5]。PRP可以分泌多種促進組織修復和再生的生長因子，包括血小板源性生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF），轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β），血小板源性表皮生長因子（platelet-derived epidermal growth factor，PDEGF），血小板源性血管生成因子（platelet derived angiogenesis factor，PDAF），胰島素樣生長因子-1（insulin-like growth factor 1，IGF-1），以及血小板因子-4（platelet factor 4，PF-4）等[6]。由于PRP具有快速釋放生長因子的特性[7]，因此有必要將其與生物支架材料聯合應用，從而達到生長因子的緩慢釋放和療效的長期發揮。

本研究的預期猜想是磷酸鈣骨水泥與富血小板血漿聯合應用的療效，要優于單純應用磷酸鈣骨水泥。為證實這一研究猜想，我們通過人工構建大鼠牙周骨缺損模型，對比了富血小板血漿-磷酸鈣骨水泥（PRP-CPC）復合物與磷酸鈣骨水泥（CPC）兩組對牙周骨缺損的修復效果。

1 材料與方法

1.1 材料的選取：選取120只人工構建的牙周骨缺損大鼠作為本研究對象，將所有入選大鼠采用隨機抽樣方式分成對照組與研究組。主要儀器與材料：①全自動血細胞計數儀、低溫高速離心設備；②人工構建大鼠均為雄性；③黑龍江的檸檬酸鈉抗凝劑，美國的牛凝血酶80 g/L氯化鈣；④日本的光學顯微鏡；⑤德國組織切片機、美國X線機。對照組60例，年齡5～10個月，平均（6.4±0.8）個月，體質量3～10 kg，平均（3.7±0.4）kg；實驗組60例，年齡6～12個月，平均（6.9±0.5）個月，體質量2～13 kg，平均（3.9±0.6）kg。所有入選大鼠的基本資料均具有可比性（P＞0.05），同時通過醫院倫理委員會批準。

1.2 處理方法

1.2.1 對照組的處理方法：治療前所有試驗動物皆需要禁水、禁食1 d，然后稱重，使用8%的水合氯醛在耳旁靜脈注射麻醉藥。待麻醉起效后，取仰臥位將大鼠固定，消毒，脫毛，操作必須控制在無菌情況下，在兩側切1 cm長的皮膚切口，將組織分離，從而造成牙周骨缺損模型，使用生理鹽水清洗切口，壓迫止血，最后在大鼠缺損處放置CPC。

1.2.2 實驗組的處理方法：研究組在骨缺損處加入PRP-CPC復合物進行治療。分別于在1～2周后取材攝大鼠兩側前肢正位X線片，對骨缺損區域的新骨形成狀況進行觀察與分析。

1.3 觀察指標

1.3.1 療效判斷。顯效：大鼠有新骨形成，成骨量較大；有效：形成新骨，成骨量無明顯變化；無效：大鼠無新骨形式，甚至惡化。以顯效和有效統計總有效率[3]。

1.3.2 影像學觀察。根據影像學手段，對大鼠成骨情況進行詳細觀察并評價。分值越高表明大鼠成骨能力越強。

1.4 統計學方法：數據統計應用SPSS17.0，計數資料應用χ2檢驗，采用（%）表示，計量資料應用t檢測，采用（±s）表示，以P＜0.05提示差異具有顯著性差異。

2 結 果

2.1 對比兩組大鼠的治療效果：實驗組總有效率（85.0%）明顯高于對照組的總有效率（75.0%）（P＜0.05），見表1。

表1 對比兩組大鼠的治療效果[n（%）]

2.2 對比兩組大鼠成骨情況：治療后2～3周內，兩組大鼠骨缺損部分均有新骨形成，并且時間越久成骨量越高。通過組織學與影像學檢查評估，實驗組成骨能力顯著高于對照組（P＜0.05），見表2。

表2 對比兩組大鼠成骨狀況（分，±s）

表2 對比兩組大鼠成骨狀況（分，±s）

組別 例數 無骨形成 骨形成 骨塑形 骨連接對照組 60 4.5±0.8 2.5±0.5 1.8±0.4 1.4±0.3實驗組 60 4.6±0.6 3.9±0.4 3.5±0.5 2.3±0.4 t- 1.345 15.227 16.118 15.661 P- ＞0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

3 討 論

本研究的結果表明，PRP-CP植入物組的骨再生能力優于CPC組，可以生成更多的新生骨組織。筆者將從PRP與CPC兩種材料之間的相容性，以及CPC對PRP產生的生長因子緩釋作用這兩個方面，對本研究產生的結果進行分析討論。

盡管CPC具有高度生物相容性以及形狀可塑等良好特性，然而這種生物材料也仍然存在一些應用缺陷，例如CPC屬于硬化后變脆的材料，而且在植入動物體內后生物可吸收性較差[8]。由于富血小板血漿可以釋放多種可促進骨再生的生長因子，因此可以作為CPC的一種很好的添加劑。有研究表明，將PRP加入到CPC粉末中，會對材料相應的彈性模量產生一定影響。與CPC材料相比，PRP-CPC的彈性模量會降低20%～50%[8]。因此研究者們認為，PRP加入到CPC粉末中，不會產生PRP添加劑與CPC基質之間不匹配的情況，也沒有導致植入物的強度降低[9]。PRP在傷口愈合部位所釋放出來的生長因子是膠原酶的激活劑，可以增加愈合組織的強度[10]。

如果將PRP溶解在液體介質中，會導致生長因子的瞬間快速釋放，這導致PRP活性在體內的快速喪失[11]。而且PRP中蛋白質的瞬間釋放并直接暴露在傷口環境中，可能會對周圍組織產生有害影響[12]。為解決PRP中生長因子快速釋放的情況，研究者們探索了是否可以提高PRP的濃度。然而，研究結果表明，如果提高PRP的濃度，過高（質量濃度超過10%）的PRP則會抑制愈合部位細胞的增殖；誘發過度骨形成和異位骨形成；并刺激破骨細胞的活性，從而的導致骨吸收[13]。因此，研究者們多年來一直在探索一種具有骨傳導性能的蛋白質控釋載體。已有體外研究表明，將PRP添加入CPC粉末中，可以促使PRP緩慢釋放生長因子直到第18天之久。在8 h到第8天對血小板源性生長因子（PDGF）的表達量的觀察發現，PRP-CPC復合物中PDGF的釋放水平維持在純PRP中PDGF釋放水平的十分之一[9]。包埋在骨水泥基質中PRP緩慢釋放生長因子的效應，也對堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP），以及ALP成骨的早期標志物產生了積極有效的影響[14]。

此外，需要提到的是，本研究也存在一些局限性：首先，這是一個基于動物體內實驗的初步研究，只通過大體和影響學觀察對療效進行評判，尚需進行進一步的組織學分析。其次，本隨機對照實驗盡管采用了嚴格的隨機對照方法，然而并未對術后指標評價者采用盲法。雖然近些年來，已有很多組織工程材料在牙周骨再生方面的研究，但此課題尚需通過更多體內外研究進行深入探索，距離臨床應用還有一定的距離。