動脈粥樣硬化病人血同型半胱氨酸與Smad7甲基化關系的研究

韋麗華

【摘要】目的：探討動脈粥樣硬化病人血同型半胱氨酸水平與Smad7基因甲基化的關系。方法：選取我校附院經頸動脈彩超確診的45名動脈粥樣硬化患者及26名健康對照，采集血液樣本進行同型半胱氨酸濃度測定及用Sequenom甲基化檢測法檢測Smad7基因甲基化水平。結果：與健康對照組相比，動脈粥樣硬化病人的血清同型半胱氨酸濃度明顯升高，同時，Smad7基因甲基化程度亦明顯升高，差異有統計學意義（P<0.001）。結論：同型半胱氨酸可能通過誘導Smad7基因啟動子的高甲基化促進動脈粥樣硬化的發生發展。Smad7基因甲基化為防治動脈粥樣硬化提供新的作用靶點。

【關鍵詞】動脈粥樣硬化；同型半胱氨酸；Smad7；Sequenom甲基化檢測法

動脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）是嚴重威害人體健康的常見病。AS的發病受許多危險因素影響，大量的流行病學資料表明，血同型半胱氨酸（Homocysteine，Hcy）水平的升高是其中的一個重要的獨立危險因素。Hcy可通過炎癥反應、細胞外基質重構、干擾甲基化反應等促進AS的發生發展[1]。據研究報道，Smad7可以抑制炎癥纖維化反應，但其在AS中的作用鮮見報道。由于Smad7基因啟動子區可受甲基化調控[2]，本研究探討AS病人血中Hcy水平與Smad7基因甲基化的關系，為AS的防治提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 研究對象及標本采集

由固定專人采用彩色超聲血流儀行兩側頸動脈檢查以確定研究對象。分別檢查雙側頸內動脈起始處、頸動脈分叉部、頸總動脈。檢查內容包括：頸動脈內膜中層厚度（IMT）及有無斑塊形成。內膜中層厚度<1.0mm為內膜中層厚度正常，以內膜局限性突出管腔，內膜厚度≥1.1mm為斑塊形成指標。疾病組病人來自2015年9月至2016年10月廣西科技大學第一附屬醫院心胸血管內科經頸動脈彩超證實有AS病變的45名患者（男33例，女12例，平均68.2歲），這些患者排除了腫瘤、結締組織病及內分泌代謝紊亂癥；對照組為經該院體檢科檢查體檢報告正常，且經頸動脈彩超檢查無IMT增厚及無AS斑塊形成的26名健康人（男19例，女7例，平均67.2歲）。疾病組和對照組在年齡、性別構成上相當。抽取AS病人和健康對照者清晨空腹肘靜脈血，全血-80℃冰箱保存備用于提取基因組DNA，血清用于Hcy濃度測定。

1.2 Hcy濃度測定

按照Hcy檢測試劑盒（邁克，中國）說明書，用循環酶法檢測AS病人和健康對照者血清Hcy濃度。

1.3 基因組DNA提取與亞硫酸氫鹽修飾

按照試劑盒（天根，中國）說明書，從AS病人和健康對照者外周血提取基因組DNA。紫外分光光度計檢測DNA的濃度及純度并通過瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。按照試劑盒（QIAGEN，瑞士）說明書，對基因組DNA進行亞硫酸氫鹽轉化。

1.4 Sequenom甲基化檢測

用EpiDesigner軟件進行引物設計。設計的引物覆蓋富含CpG位點的Smad7基因啟動子區。如圖1所示，擴增區位于轉錄起始點附近，從-619到-196。正向引物序列為5-aggaagagagTGGTAGAAGAAAAGGAGAGGAAGAT-3'，反向引物序列為5-cagtaatacgactcactatagggagaaggctAAAACCTCTTTCCCCCTTACTAAAC-3。經亞硫酸氫鹽修飾的基因組DNA進行PCR擴增反應，條件如下：變性94℃ 4分鐘，（94℃ 20秒，56℃ 30秒，72℃ 60秒）循環45次，最后72℃延長3分鐘。之后進行SAP酶消化處理和酶切反應，樹脂純化后上機檢測。

1.5 統計分析

實驗數據以均值士標準誤表示，兩組間比較采用SPSS16.0統計軟件進行t檢驗，P<0.05差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Hcy測定結果

與健康對照者相比，AS病人的血清Hcy濃度明顯升高，差異有統計學意義（P<0.001）（圖2）。

2.2 Sequenom甲基化檢測結果

選取Smad7基因啟動子區第5，8，15，16CpG位點的CpG比值的平均值來進行比較。結果顯示，與健康對照者相比，AS病人的甲基化程度明顯升高，差異有統計學意義（P<0.001）（圖3）。

3 討論

AS的致病機制包括細胞外基質堆積、炎癥反應及DNA甲基化紊亂。Hcy，一種含硫氨基酸，是體內甲硫氨酸循環的正常代謝產物，是能量代謝及許多需甲基化反應的重要的中間產物。正常狀態下，血漿Hcy濃度為5～15μmol/L，超出此范圍即為高Hcy血癥。DNA甲基化是表觀遺傳修飾的一種。隨著近年來對表觀遺傳學的深入研究，Hcy對心血管疾病發病的表觀遺傳學調控受到越來越多的關注。DNA的甲基化在Hcy致AS發病中發揮了重要的作用。在AS病損部位，呈現整個基因組低甲基化和部分特異基因啟動子區CpG島的高甲基化。基因高甲基化，低表達。Smad7可以抑制炎癥纖維化反應，在許多疾病中發揮重要作用[3，4]，但其在AS中的作用鮮見報道。近期研究報道，Smad7基因啟動子區可受甲基化調控，在大鼠的肝纖維化病變中，Smad7高甲基化低表達[2]。本研究分析的Smad7啟動子區包含一個CpG島（16個CpG位點），覆蓋TATA-box和GC-box，與基因轉錄密切相連。所采用的Sequenom甲基化檢測法能夠特異性地定量分析多個CpG位點甲基化水平，準確高效。由結果得知，隨著AS病人血清Hcy濃度的升高，其Smad7基因啟動子區甲基化水平也明顯升高。因為高甲基化影響基因的轉錄，據此推測Smad7低表達從而促進AS的炎癥纖維化病變。

綜上所述，Hcy可能通過誘導Smad7基因啟動子的高甲基化促進AS的發生發展。檢測Smad7啟動子甲基化水平可輔助臨床上對AS的診斷，而Smad7基因的甲基化也為防治AS提供新的作用靶點。

參考文獻

[1]Dionisio N，Jardí n I，Salido GM，etal.，Homocysteine，intracellularsignaling and thromboticdisorders，Curr MedChem.17（2010）3109-3119.

[2]E.B.Bian，C.Huang，H.Wang，etal.，Repression of Smad7 mediatedby DNMTldetermines hepaticstellate cell activation andliver fibrosis in rats，ToxicolLett，224（2014）175-185.

[3]Liu Z，HuangXR，ChenHY，etal.，Deletion of Angiotensin-ConvertingEnzyme-2 PromotesHypertensiveNephropathy by Targeting Smad7for Ubiquitin Degradation，Hypertension.70（2017）：822-830.

[4]BianL，HanG，ZhaoCW，etal.，The roleof Smad7 in oral mucositis，ProteinCell.2015：160-169.