人參皂苷20（sRg3對llcpk1細胞中順鉑所致腎毒性的保護作用

吳勝斌　王應燈

摘要目的：探討人參皂苷20（s）Rg3對llcpk1細胞中順鉑所致腎毒性的保護作用。方法：通過基于細胞的腎臟保護試驗，研究了發酵黑參（FBG）及其活性成分人參皂苷20（S）Rg3對豬腎（LLCPK1）細胞中順鉑（化療藥物）誘導的損傷的保護作用。結果：由順鉑誘導的細胞活力降低，再使用FBG提取物和人參皂苷20（S）Rg3依賴劑量后明顯恢復。用FBG提取物或人參皂苷20（S）Rg3處理后會降低順鉑誘導升高與磷酸化cJun N末端激酶（JNK），p53和裂解的半胱天冬酶3升高的蛋白。通過用FBG和人參皂苷20（S）Rg3的共同處理，由于順鉑的誘導導致凋亡LLCPK1細胞升高的百分比顯著降低。結論：人參皂苷20（s）Rg3可改善LLCPK1的細胞毒性，人參皂苷20（S）RG3可能是通過阻斷JNKP53caspase3信號級聯反應來介導這種作用的重要組成部分。

關鍵詞順鉑；人參皂苷20（S）Rg3；llcpk1細胞；cJun N末端激酶；腎毒性；發酵黑參；絲裂原活化蛋白激酶；細胞外調節蛋白激酶；磷酸脫氫酶；甘油醛3磷酸脫氫酶

Protective Effects of Ginsenoside 20 （s）Rg3 on Renal Toxicity Induced by Cisplatin in llcpk1 Cells

Wu Shengbin， Wang Yingdeng

（Department of Nephrology， the Ninth People′s Hospital， School of Medicine， Shanghai Jiaotong University， Shanghai 200011， China）

AbstractObjective：To discuss protective effects of ginsenoside 20 （s）Rg3 on renal toxicity induced by cisplatin in llcpk1 cells. Methods：The protective effect of fermented black ginseng （FBG） and its active ingredient ginsenoside 20 （S） Rg3 on cisplatin induced damage induced by cisplatin （chemotherapeutic drugs） in pig kidney （LLCPK1） cells was studied by cell based renal protection test.This article studied the protective effect of fermentation of black ginseng cells （FBG） and its active component ginsenoside 20 （S）Rg3 on porcine kidney （LLCPK1） cells in cisplatin （chemotherapy）induced injury based on kidney protection test. Results：The cisplatin induced cell viability decreased， and then FBG was used to extract and ginsenoside 20 （S）Rg3 was restored by FBG. After the dose dependent or extract ginsenoside 20 （S） afterRg3 treatment may reduce cisplatin induced increased phosphorylation of cJun and Nterminal kinase （JNK）， p53 and caspase cleavage the increase of3 protein. By using FBG and 20 ginsenosides （S） together withRg3， the percentage of cisplatin induced apoptosis in LLCPK1 cells leaded to increased significantly. Conclusion：FBG and its major ginsenoside 20（S）Rg3， ameliorated cisplatininduced nephrotoxicity in LLCPK1 cells by blocking the JNKep53ecaspase3 signaling cascade.

Key WordsCisplatin； Ginsenoside 20 （S）Rg3； llcpk1 cell； cJun Nterminal kinase； Nephrotoxicity； FBG； MAPK； ERK； Phosphate dehydrogenase； Glyceraldehyde3phosphate dehydrogenase

中圖分類號：R284文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.08.045

人參是最著名的中草藥之一，其個體成分可增強腎功能[1]。人參通過減弱氧化應激有效地改善了大鼠鏈脲佐菌素誘導的腎功能障礙[24]。最近，評價人參引起的藥物腎毒性的作用，以及參與這一反應的機制和活性成分，還有人參潛在的腎臟保護功效成為人們感興趣的研究領域[57]。人參可防止大鼠慶大霉素（一種氨基糖苷類抗生素）引起的腎損傷[1]。慶大霉素誘導的腎毒性與氧化損傷有關。與人參共同施用，通過抑制自由基形成和抗氧化系統的恢復來減少慶大霉素誘導的腎損傷。在人參的幾個成分中，酚酸、黃酮，負責增加腎血流量和消除自由基，表現出對慶大霉素誘導的氧化毒性的保護作用[811]。

目前對開發方法已經進行了研究，可使用熱加工來提高人參轉換為達瑪烷型皂苷的藥理功效。按照這個概念，已經準備了黑參作為原料人參來進行熱加工和發酵。雖然一些對于人參的研究集中在其對糖尿病的保護作用[3]，但還不清楚黑參對藥物誘導的腎毒性的影響。

本研究旨在研究黑參及其活性成分人參皂苷20（S）Rg3對豬腎（LLCPK1）細胞中順鉑（化療藥物）誘導的損傷的腎臟保護作用。此外，我們著重評估絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）作為黑參在腎臟保護作用中的重要影響。

1材料與方法

11材料

111細胞

豬腎（LLCPK1）細胞（美國，美國典型培養物保藏中心）。

112藥物

人參皂苷20（S）Rg3（中國，長春市凱瑞化學試劑經銷站）；順鉑（美國，美國Sigma公司）。

113試劑與儀器

DMEM培養基（美國，美國Sigma公司）；胎牛血清（美國，Thermo公司）；p38促分裂素原活化蛋白激酶試劑盒（美國，美國Sigma公司）；EzCytox試劑（美國，美國Sigma公司）；磷酸化p38試劑盒，p44/42（美國，美國Abcam公司）促分裂素原活化蛋白激酶細胞外信號調節激酶試劑盒（美國，美國Abcam公司）；放射免疫沉淀測定緩沖液（美國，美國Sigma公司）；磷酸化p44/42，cJunN末端激酶試劑盒（JNK）（美國，美國Abcam公司）；化學發光預先蛋白質印跡檢測試劑（美國，美國R&D公司）；Tali凋亡試劑盒（美國，美國Invitrogen公司）；磷酸化末端激酶試劑盒（美國，美國Abcam公司）；p53，裂解的半胱天冬酶3試劑盒（美國，美國Abcam公司）；甘油醛3磷酸脫氫酶試劑盒（GAPDH）（美國，美國Abcam公司）和辣根過氧化物酶綴合的抗兔抗體試劑盒（美國，美國Abcam公司）。

細胞培養箱（美國，Thermo公司）；酶標儀（美國，BioRad公司）；凝膠成像儀（美國，BioRad公司）；Tali圖像的細胞儀（美國，Thermo公司）；Fusion Solo化學發光系統（法國，法國VILBER公司）。

12方法

121分組與模型制備

人參干粉提取物由北京同仁堂吉林人參有限責任公司提供。四年生白參是從大連富生制藥有限公司購買的。人參的真實性是根據成分配方確定的。黑參在85 ℃下通過9個循環反復蒸煮白參8 h并在50 ℃下干燥48 h制備。為了制備人參提取物，將黑參粉碎成粉末，并用10倍體積的蒸餾水，在80 ℃ 72 h萃取1次，然后過濾并冷卻。人參提取物用酵母菌（丹麥格林納拉勒曼德）在34 ℃下發酵25 h。發酵后，將黑參提取物在85 ℃滅菌22 h，然后凍干。本研究中使用的黑參提取物中的人參皂苷Rg2，Rg3，Rh1，Rh2和Rf分別為286 mg/mL，2452 mg/mL，1262 mg/mL，063 mg/mL和132 mg/mL[12]。

122檢測指標與方法

評估對順鉑所致腎細胞損傷的保護作用：使用LLCPK1細胞評估對抗氧化腎細胞損傷的保護作用[1213]。LLCPK1細胞從美國典型培養物保藏中心購買，并在空氣中含5%的CO2和37 ℃的環境中培養含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素和4 mmol/L L谷氨酰胺的DMEM培養基。將每空1×10個細胞接種在96孔培養板中，并使其粘附2 h。然后，將試驗樣品、自由基供體25 μmol/L順鉑或兩者均加入培養基中。培養24 h后，除去含有測試樣品、自由基供體或兩者的培養基。在37 ℃將細胞在無血清培養基（90 mL/孔）和EzCytox試劑（10 mL/孔）中培養2 h。通過使用酶標儀測量450 nm處的吸光度來測定細胞活力。

蛋白印跡分析：全細胞提取物制備按照制造商的說明使用放射免疫沉淀測定緩沖液，以1 mmol/L苯甲基磺酰氟作為輔助。蛋白質（全細胞提取物，20 mg/泳道）在預制415迷你PROTEAN TGX凝膠電泳分離后涂抹到聚偏氟乙烯（PVDF）膜，并利用表位特異性原發性和繼發性抗體進行分析。使用增強的化學發光預先蛋白質印跡檢測試劑和Fusion Solo化學發光系統以顯現結合的抗體。

基于圖像的流式細胞儀測定：LLCPK1細胞用于基于圖像的凋亡測定系統。所有測定均按照用于操作Tali圖像的細胞儀的指南進行。細胞在37 ℃，5%CO2的環境下用樣品處理24 h。使用TrypLE試劑通過胰蛋白酶處理后收獲細胞，并使用Tali凋亡試劑盒進行染色。對樣本進行獨立劃分和分析并按照制造商推薦的協議使用Tali圖像和流動細胞儀廠家。通過用膜聯蛋白VAlexa Fluor 488綴合物染色測定細胞群的凋亡部分。碘化丙啶（PI）用于從凋亡細胞（Annexin V陽性/PI陰性）分化死細胞（膜聯蛋白V陽性/PI陽性或膜聯蛋白V陰性/PI陽性）。由Tali式細胞儀測出存活的、凋亡的和死亡的細胞群的百分比與來自同一樣品獨立運行的流式細胞儀上的數據是類似的[1415]。

13統計學方法

采用SPSS 200統計軟件進行數據分析。用多重比較檢驗和方差分析。以P<005為差異有統計學意義。

2結果

在本研究中，我們試圖確定黑參提取物及其活性人參皂苷20（S）Rg3的腎臟保護作用以及所涉及的機制，以確定其治療潛力。我們進行了基于細胞的腎臟保護試驗，以評估黑參提取物和人參皂苷20（S）Rg3對LLCPK1細胞的保護作用。使用LLCPK1細胞系建立腎細胞保護試驗條件，該細胞系通常用于評估腎毒性[1617]。用25 μmol/L的順鉑治療后，控制LLCPK1細胞存活率降低到60%。使用黑參及人參皂苷20（S）RG3后，由順鉑導致降低得細胞存活率明顯恢復（圖1）。黑參提取物和人參皂苷20（S）Rg3分別控制在500 mg/mL和250 mg/mL水平改善了順鉑導致的腎毒性。

正常的MAPK信號轉導的失調與急性與慢性腎臟疾病有關[18]。在本研究中，我們試圖確定MAPKsp53caspase凋亡級聯在介導黑參和人參皂苷20（S）Rg3對腎細胞中氧化細胞毒性的保護作用中所扮演的成分。如圖2所示，順鉑治療24 h后，觀察磷酸化氨基末端激酶在用黑參及人參皂苷20（S）RG3處理后下降。然而，pERK和pP38沒有明顯的變化（數據未顯示）。

順鉑誘導的腎毒性依賴于DNA損傷誘導的細胞凋亡。p53的蛋白水平在使用順鉑治療后顯著增加，而經高濃度的黑參及人參皂苷20（S）RG3治療后大幅減少。類似地，用黑參和人參皂苷20（S）Rg3處理后，升高的切割的半胱天冬酶3水平也降低了。圖3顯示黑參提取物和人參皂苷20（S）Rg3對LLCPK1細胞凋亡的影響。如圖3A所示，使用順鉑治療后，被紅綠熒光染色的凋亡及死亡細胞的數量增加了，其數量在經黑參尤其是與人參皂苷20（S）RG3聯合治療后降低。用黑參和人參皂苷20（S）Rg3進行聯合治療后，順鉑治療誘導的凋亡LLCPK1細胞升高百分比明顯降低（圖3B）。

3討論

人參皂苷是三萜烷磺酸衍生的30碳糖苷，是人參的主要活性成分。人參皂苷抑制正常大鼠腎細胞中斑蝥素誘導的細胞毒性。人參皂苷經預處理降低了大鼠血清肌酐，尿蛋白，血尿素氮和組織學變化的增加[19]。這些結果可能反映了某些人參皂苷可改善藥物性腎毒性腎功能不全。

順鉑誘導的腎損傷與自由基和氧化應激的形成有關，這種損傷可激活MAPKs[2022]。用抗氧化劑和胱天蛋白酶抑制劑治療可以緩解順鉑相關腎毒性的作用。有相當多的證據表明該蛋白激酶、p53和半胱天冬酶途徑在凋亡途徑的調控以及炎性反應過程中發揮重要作用。本研究結果表明JNKp53caspase3信號級聯在介導黑參人參皂苷20（S）Rg3對培養的LLCPK1細胞中氧化細胞毒性的保護作用方面起關鍵作用。

人參通過減輕包括超氧化物歧化酶，谷胱甘肽過氧化物酶，過氧化氫酶和谷胱甘肽S轉移酶在內的抗氧化酶的活性以及谷胱甘肽的水平，顯示出對順鉑誘導的腎毒性的保護作用。這種效應從而降低了氧化應激、生化指標的改變、組織學改變、基因組DNA損傷、以及表達TNFa、白細胞介素6、腫瘤抑制基因p53等指標。人參皂苷F11經預處理降低了順鉑誘導的血尿素氮和肌酐水平的升高，改善了組織病理學損傷。進一步的研究表明，F11抑制p53的活化，反轉了B細胞淋巴瘤2相關X蛋白/B細胞淋巴瘤2的比例，順鉑誘導的抗氧化和自由基水平反過來抑制了腎小管細胞凋亡[2324]。然而，人參皂苷20（S）Rg3的效果和作用機制到目前為止尚未確定。

總之，我們的研究結果表明，人參皂苷20（s）Rg3可改善LLCPK1的細胞毒性，人參皂苷20（S）RG3可能是通過阻斷JNKP53caspase3信號級聯反應來介導這種作用的重要組成部分。

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（2017-11-03收稿責任編輯：楊覺雄）