秦皮乙素抑制多柔比星毒性的分子機(jī)制研究

李瀟 徐繁 房亮 張圣林 姜海軍 趙博

【摘要】目的探討秦皮乙素（Esc）對多柔比星（DOX）誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。方法培養(yǎng)H9C2心肌細(xì)胞并分為空白組、DOX組、Esc+DOX組，透射電鏡觀察各組細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，蛋白免疫印跡法檢測各組Bmi1的表達(dá)情況。將細(xì)胞重新分為3組：DOX組，空白siRNA轉(zhuǎn)染組（Esc+DOX+NC siRNA）和Bmi1 siRNA轉(zhuǎn)染組（Esc+DOX+Bmi1 siRNA），蛋白免疫印跡法檢測各組Bmi1的表達(dá)情況，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況和細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的含量。結(jié)果DOX組細(xì)胞腫脹、線粒體嵴斷裂，Bmi1表達(dá)低于Esc+DOX組（P<001）；Bmi1 siRNA轉(zhuǎn)染組H9C2細(xì)胞凋亡數(shù)量、ROS含量高于空白siRNA組（P均<001），Bmi1表達(dá)低于空白siRNA轉(zhuǎn)染組（P<001）。結(jié)論秦皮乙素可減輕多柔比星誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞的凋亡，其作用機(jī)制可能與抑制Bmi1表達(dá)，從而調(diào)節(jié)線粒體功能及減少ROS的產(chǎn)生有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】多柔比星；秦皮乙素；線粒體；Bmi1

Molecular mechanism of the effect of esculetin on relieving doxorubicin toxicityLi Xiao， Xu Fan， Fang Liang，Zhang Shenglin， Jiang Haijun，Zhao BoAffiliated Hospital of Chengde Medical College，Chengde 067000，China

Corresponding author，Xu Fan，Email：28574060@qqcom

【Abstract】ObjectiveTo investigate the protective effect and mechanism of esculetin （Esc） on doxorubicin（DOX）induced injury in H9C2 cells MethodsH9C2 myocardiac cells were cultured and divided into the control， DOX and Esc+DOX groups The ultrastructure of the cells in each group was observed by transmission electron microscope The expression of Bmi1 in each group was detected by western blot The cells were then divided into three groups： DOX， Esc+DOX+NC siRNA and Esc+DOX+Bmi1 siRNA groups Western blot was used to detect the expression of Bmi1 in each group The cellular apoptosis and the content of intracellular reactive oxygen species （ROS） were detected by flow cytometry ResultsIn the DOX group， cell swelling and mitochondrial cristae breakeage were observed and the expression of Bmi1 was significantly lower than that in the Esc+DOX group （P<001） In the Esc+DOX+Bmi1 siRNA group， the quantity of apoptotic cells and the content of ROS were significantly higher than that in the Esc+DOX+NC siRNA group（both P<001）， and the expression of Bmi1 was significantly lower than that in the Esc+DOX+NC siRNA group （P<001） ConclusionsEsc can mitigate the DOXinduced injury in the H9C2 cells The underlying mechanism is probably correlated with the downregulated expression level of Bmi1， thereby modulating the mitochondrial function and reducing the production of ROS

【Key words】Doxorubicin； Esculetin； Mitochondria； Bmi1

多柔比星為蒽環(huán)類抗生素，具有廣譜抗腫瘤作用，但其對正常細(xì)胞（心臟、肝臟、腎臟等細(xì)胞）具有毒性作用，嚴(yán)重制約多柔比星的臨床應(yīng)用[1]。有研究表明，當(dāng)多柔比星的累積總量大于600 mg/m2時，心力衰竭的發(fā)生率達(dá)36%[2]。多柔比星誘導(dǎo)心臟毒性的機(jī)制比較復(fù)雜，包括刺激自由基形成增加、線粒體損傷、細(xì)胞凋亡等，其對正常細(xì)胞的毒性主要為線粒體功能破壞、線粒體損傷[3]。秦皮乙素是中藥秦皮的主要活性成分，可清除氧自由基、保護(hù)細(xì)胞免受過氧化物造成的損傷，之前已有研究證實Bmi1基因在DNA損傷應(yīng)答、維持線粒體功能和活性氧（ROS）平衡過程中發(fā)揮重要的作用[4]。在本研究中我們首次探究了秦皮乙素對H9C2細(xì)胞內(nèi)Bmi1表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，以探討秦皮乙素保護(hù)多柔比星致心肌細(xì)胞損傷的可能機(jī)制。

材料與方法

一、材料

大鼠胚胎心肌細(xì)胞H9C2，來源于中國科學(xué)院細(xì)胞庫。RPMI1640培養(yǎng)基（貨號：SH3080901B）和胎牛血清（FBS貨號：SV3008703），購于HyClone Laboratories公司（美國）；GAPDH的一抗（兔多抗，貨號：104941AP）、二抗（羊抗兔IgG HRP抗體，貨號：104941AP）購于Proteintech公司（中國武漢）；Bmi1 siRNA（貨號：6442S ）和NC siRNA（貨號：abx918119 ）均來自生興生物公司（中國南京）；DCFHDA（貨號：D6470）購于Invitrogen公司（美國）；多柔比星（貨號：ASD807）、秦皮乙素（貨號：YMWS1229）購于阿拉丁生物化學(xué)技術(shù)有限公司（中國上海）。

二、細(xì)胞培養(yǎng)及分組

H9C2細(xì)胞用含有10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞覆蓋培養(yǎng)瓶底部的80%時，使用胰蛋白酶消化以制備單細(xì)胞懸液。然后將H9C2細(xì)胞接種到96孔板，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個/ml，細(xì)胞分為3組：空白組（Control）、多柔比星（DOX）組、秦皮乙素（Esc+DOX）組。空白組細(xì)胞只加培養(yǎng)基，秦皮乙素組細(xì)胞加入10 μmol/L秦皮乙素培養(yǎng)2 h[5]；然后在Dox和Esc+Dox組細(xì)胞加入8 μmol/L多柔比星繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞待用。

三、透射電子顯徼鏡觀察線粒體結(jié)

收集各組細(xì)胞，加入25%戊二醛在4 ℃的冰箱中固定48 h；再用1%四氧化鋨在4 ℃固定30 min；用系列丙酮在室溫下脫水；然后用包埋劑包埋，用超薄切片機(jī)切片并染色，透射電子顯微鏡檢測線粒體結(jié)構(gòu)改變。

四、Bmi1在H9C2細(xì)胞中的表達(dá)及其對細(xì)胞損傷的影響

1通過胰蛋白酶消化收集各組細(xì)胞

使用BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度，通過SDS聚丙烯酰胺凝膠將細(xì)胞抗原按分子量大小分離，濕式轉(zhuǎn)膜將蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，分別加入Bmi1、GAPDH一抗（用一抗稀釋液將一抗按照1∶1 000稀釋）4 ℃孵育過夜，再分別加入二抗（用二抗稀釋液將二抗按照1∶2 000稀釋）室溫下2 h，在暗室中將ECL發(fā)光液覆蓋于膜表面，用化學(xué)發(fā)光熒光影像分析儀進(jìn)行曝光，檢測各組Bmi1的表達(dá)。

2實驗細(xì)胞分組

將細(xì)胞重新分為3組：DOX組、空白siRNA轉(zhuǎn)染組（Esc+DOX+NC siRNA）和Bmi1 siRNA轉(zhuǎn)染組（Esc+DOX+Bmi1 siRNA）。將300 pmol Bmi1 siRNA和300 pmol空白siRNA加入到2 ml無血清OptiMEM I培養(yǎng)基中，將LipofectamineTM RNAiMAX加入（20 μl）至2種溶液中，然后充分混合并加入細(xì)胞中。孵育48 h后，通過蛋白免疫印跡法檢測每組Bmi1的表達(dá)；然后用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡情況；在每組細(xì)胞中加入10 μmol/L DCFHDA染色溶液，37℃避光孵育20 min，采用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞ROS的水平。

五、統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 190進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Tukey法，P<005為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

一、秦皮乙素可減輕多柔比星誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞毒性線粒體功能紊亂

電鏡結(jié)果顯示，DOX組出現(xiàn)H9C2細(xì)胞腫脹，線粒體嵴發(fā)生破裂。在Esc+DOX組中，H9C2細(xì)胞保持正常完整的線粒體（圖1）。

二、秦皮乙素對多柔比星誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞Bmi1表達(dá)和細(xì)胞損傷的影響

蛋白免疫印跡分析表明，與DOX組相比，Esc+DOX組內(nèi)Bmi1表達(dá)增加（圖2A）。在敲除Bmi1后，與空白siRNA組相比，Bmi1 siRNA組中的Bmi1蛋白表達(dá)降低（圖2B），細(xì)胞凋亡率升高（圖2C），ROS水平升高（圖2D）。因此，秦皮乙素對多柔比星誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的作用機(jī)制是上調(diào)Bmi1的表達(dá)。

討論

多柔比星是抗腫瘤譜廣、活性強(qiáng)、在國內(nèi)外被廣泛使用的抗腫瘤藥物。但長期使用時，由于劑量累積作用，存在嚴(yán)重的毒副反應(yīng)，尤其是骨髓與心臟的毒性，大大限制了多柔比星的應(yīng)用。多柔比星產(chǎn)生心臟毒性的機(jī)制很多，包括線粒體功能紊亂、ROS水平增高等[6]。本研究結(jié)果表明多柔比星會使線粒體的形態(tài)發(fā)生改變，增加了H9C2細(xì)胞內(nèi)

Bmi1基因是多梳基因家族PcG的重要成員之一，由多種轉(zhuǎn)錄抑制因子組成，以多蛋白復(fù)合體的形式調(diào)控靶基因的表達(dá)，在細(xì)胞的增殖能力、細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡等生命現(xiàn)象中發(fā)揮著重要作用[7]。近來研究顯示，Bmi1也在多種惡性腫瘤異常表達(dá)，包括乳腺癌、宮頸癌和肺癌等，與腫瘤的生物學(xué)特性和患者的預(yù)后轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)，被認(rèn)為是一種新的腫瘤標(biāo)志物和潛在的治療靶點[8]。Bmi1通過調(diào)節(jié)與線粒體功能和ROS產(chǎn)生相關(guān)的基因表達(dá)來調(diào)節(jié)線粒體功能。研究顯示Bmi1基因缺失的細(xì)胞線粒體功能遭到了破壞，ROS水平升高，說明Bmi1可以直接調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧化壓力[9]。

本研究表明，秦皮乙素可以抑制多柔比星導(dǎo)致的Bmi1表達(dá)減少，從而調(diào)節(jié)線粒體功能及減少ROS的產(chǎn)生，減輕多柔比星對心肌細(xì)胞的毒性。有研究表明，Bmi1是miRNA132的下游靶基因，過表達(dá)miRNA132之后，可抑制Bmi1 的表達(dá)[10]。秦皮乙素減輕多柔比星致心臟毒性的其他機(jī)制尚需深入探討，但本研究可為相關(guān)臨床研究提供實驗依據(jù)。

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（收稿日期：20171206）

（本文編輯：楊江瑜）