非小細胞肺癌患者胸腔積液與外周血ctDNA中EGFR基因突變檢測的對比研究

徐敏 何婉 李嵐 朱美琴 陳亦欣 許瑞蓮

【摘要】目的比較晚期非小細胞肺癌（NSCLC）患者胸腔積液與外周血循環腫瘤DNA（ctDNA）中EGFR基因突變間的差異。方法用高通量測序技術同時檢測22例晚期NSCLC患者的胸腔積液ctDNA與外周血ctDNA的EGFR基因突變情況，以外周血ctDNA為金標準，分析胸腔積液ctDNA對EGFR基因突變的檢測效果。結果以外周血ctDNA檢出的EGFR基因突變結果為金標準，胸腔積液ctDNA中檢出NSCLC基因突變的靈敏度為86%～100%，特異度達94%～100%，與外周血ctDNA結果的總體符合率為95%～100%，且胸腔積液ctDNA檢測出的突變豐度高于外周血ctDNA（P=0002）。結論晚期NSCLC患者胸腔積液和外周血ctDNA中EGFR基因突變檢測結果一致，胸腔積液檢測豐度較高，具有良好的臨床應用價值。

【關鍵詞】非小細胞肺癌；高通量基因測序；循環腫瘤脫氧核糖核酸

Comparison of EGFR gene mutation detection between pleural effusion and peripheral blood ctDNA in patients with nonsmall cell lung cancerXu Min， He Wan， Li Lan， Zhu Meiqin， Chen Yixin， Xu Ruilian Department of Medical Oncology， Shenzhen Peoples Hospital， the Second Clinical Medical College of Jinan University， Shenzhen Cancer Institute， Shenzhen 518020， China

Corresponding author， Xu Ruilian， Email： xuruilian@126com

【Abstract】ObjectiveTo compare the differences in the EGFR gene mutation detection between the pleural effusion and peripheral blood circulating tumor DNA （ctDNA） in patients with advancedstage nonsmall cell lung cancer （NSCLC） MethodsThe EGFR gene mutation in the pleural effusion and peripheral blood ctDNA of 22 patients with advancedstage NSCLC were detected by nextgeneration sequencing （NGS） The ctDNA gene detection in the peripheral blood was considered as the golden standard The detection effect of EGFR gene mutation upon the pleural effusion ctDNA was evaluated ResultsThe EGFR gene mutation in the peripheral blood ctDNA was considered as the golden standard The sensitivity of detection of NSCLC gene mutation in pleural effusion ctDNA was 86%100% and the specificity was 94%100% The overall consistent rate with the results of peripheral blood ctDNA was ranged from 95% to 100% The mutation abundance detected in the pleural effusion ctDNA was significantly higher than that in the peripheral blood ctDNA（P=0002） ConclusionsThe outcomes of EGFR gene mutation are consistent between the pleural effusion and peripheral blood of patients with advanced NSCLC The mutation abundance of the pleural effusion is higher compared with that of the peripheral blood， which is worthy of clinical significance

【Key words】Nonsmall cell lung cancer； Nextgeneration sequencing； Circulating tumor DNA

非小細胞肺癌（NSCLC）占全部肺癌患者發病率的80%～85%，其中約50%的患者確診時已為晚期，5年生存率低于5%。隨著分子病理學的發展，越來越多肺癌驅動基因被發現，給患者帶來了全新的治療策略。表皮生長因子受體基因（EGFR）作為最受關注的肺癌靶標基因，其突變狀態是決定EGFR酪氨酸激酶抑制劑（EGFRTKI）療效的關鍵。然而目前臨床上大部分NSCLC患者在確診時已為ⅢB～Ⅳ期，無法手術，無法獲取腫瘤組織或組織不足造成難以進行分子檢測。近年有研究表明，外周血循環腫瘤DNA（ctDNA）所檢測的EGFR突變與組織DNA檢測的特異度相似，靈敏度尚待提高[13]。而ctDNA中檢出EGFR突變陽性者接受EGFRTKI治療生存期獲得延長[12]。基于此，通過外周血ctDNA檢測EGFR基因突變已獲得專家認可，達成共識[4]。晚期NSCLC患者常伴有惡性胸腔積液（MRE），胸腔積液的采集較為簡便、易行，對于無法獲取腫瘤組織的患者而言也是一個良好的基因檢測替代標本。然而，胸腔積液ctDNA與外周血ctDNA用于EGFR基因檢測時何種更精確尚未知。為此，近期筆者通過高通量基因測序亦稱下一代測序（NGS）技術檢測22例晚期NSCLC患者胸腔積液ctDNA中的EGFR基因突變情況，并以外周血ctDNA作對照，現報告如下。

對象與方法

一、研究對象

選取2014年11月至2015年12月我院收治的ⅢB～Ⅳ期NSCLC合并MRE（經細胞病理學證實）患者22例，所有患者均抽取外周血及胸腔積液標本。其中男13例、女9例，年齡35～70歲、中位年齡50歲，腺癌20例、鱗癌2例。本研究經醫院醫學倫理委員會批準，所有患者均已經簽署知情同意書。

二、方法

1采集血樣及抽取胸腔積液

清晨在患者空腹狀態下抽取肘靜脈血5 ml，立即在室溫下以2 000轉/分離心10 min，分離血漿和血細胞，小心采集上層血漿，注意避免觸及血細胞。臨床抽取新鮮胸腔積液樣本約15 ml，同樣以2 000轉/分離心10 min，棄上清。如細胞量過少，可重復加入胸腔積液后再離心。

2血漿和胸腔積液樣本DNA提取

用Qiagen DNA提取試劑盒提取血漿和胸腔積液樣本中的DNA，具體操作參照試劑盒說明書進行。

3ctDNA分離

應用薄膜柱吸附試劑盒分別從血漿和胸腔積液中分離ctDNA：將DNA定量后按試劑盒說明書取20 ng以上進行DNA文庫構建，步驟包括：ctDNA大片段分離、小片段回收、DNA末端修復和A接頭連接、在DNA的兩端加上Illumina測序試劑盒的專用接頭、依據所需DNA片段大小進行磁珠篩選、應用PCR法擴增文庫用于探針雜交捕獲及測序實驗。

4生物素標記探針捕獲基因

應用雜交富集探針（Geneseeq）對已建好的DNA文庫進行目標基因靶標富集及擴增，包括：DNA捕獲探針與文庫雜交；清洗和回收捕獲的文庫產物；捕獲文庫與鏈霉親和素磁珠結合；磁珠捕獲文庫清洗，去除非特異性結合的文庫。

5高通量基因測序

血漿樣本和胸腔積液提取ctDNA后送南京世和基因生物技術有限公司進行全基因檢測。將捕獲后的文庫在Illumina HiSeq 4000高通量測序平臺上樣，DNA在Illumina試劑盒Flew cell上形成DNA簇，測序平臺相繼通過單堿基合成后暫停、熒光檢測、合成恢復的循環完成DNA高通量測序。

6數據分析

將高通量基因測序結果與中國人種hg19基因組數據對比，完成基因Mapping工作。同步分析各種基因突變類型，分析生成腫瘤特有突變和種系突變。

三、統計學處理

應用SPSS 200分析數據。以外周血ctDNA結果為對照，分析各病例胸腔積液ctDNA對NSCLC基因突變的診斷效能，計算胸腔積液ctDNA診斷NSCLC基因突變的靈敏度、特異度及總體符合率。用符號秩和檢驗對比胸腔積液和血漿EGFR基因突變檢測豐度。P<005為差異有統計學意義。

結果

一、胸腔積液的EGFR基因突變情況分析

22例合并MRE的NSCLC患者的胸腔積液標本中，12例檢測到EGFR基因突變，突變率為55%（12/22）。12例EGFR基因突變標本包括：5例（42%）19號外顯子缺失突變，該5例中有1例同時合并20號外顯子T790M原發耐藥突變；6例（50%）21號外顯子L858R點突變；1例不常見的A289F突變。19外顯子缺失突變和21外顯子L858R點突變共占總體突變類型的92%（11/12）。

二、外周血的EGFR基因突變情況分析

22例合并MRE的NSCLC患者的外周血標本中，11例檢測到EGFR基因突變，突變率為50%（11/22）。11例EGFR基因突變的標本包括：5例（42%）19號外顯子缺失突變，該5例中有1例同時合并20號外顯子T790M原發耐藥突變；5例（42%）21號外顯子L858R點突變；1例不常見的A289F突變。19外顯子缺失突變和21外顯子L858R點突變共占總體突變類型的91%（10/11）。

三、配對樣本中胸腔積液和外周血EGFR基因突變的一致性及檢測豐度的比較

以外周血ctDNA檢出的基因突變結果為金標準，胸腔積液ctDNA對NSCLC基因突變的靈敏度為86%～100%，特異度達94%～100%，與外周血ctDNA結果的總體符合率為95%～100%，見表1。其中，有1例患者外周血ctDNA中未檢出突變，但相應胸腔積液ctDNA中則檢測出EGFR 21號外顯子L858R點突變。而在檢測豐度方面，胸腔積液ctDNA檢測出的突變豐度高于外周血ctDNA（Z=-3509，P=0002）。

討論

在目前NSCLC的診治中，基因分型指導下的個體化治療對于指導用藥至關重要。其中，針對EGFR基因突變的EGFRTKI的應用給NSCLC患者帶來了巨大的生存獲益。但是，大部分NSCLC患者在診斷時均為晚期，難以獲取腫瘤組織。而且，由于腫瘤的異質性，根據初診時的組織標本指導后續的治療可能存在偏倚。鑒于此，液體活組織檢查（活檢）技術在腫瘤分子檢測中嶄露頭角，體液（主要為外周血，還有胸腹腔積液、尿液、唾液）中的循環腫瘤細胞（CTC）、ctDNA、外泌體等腫瘤來源的生物標志物，為肺癌的精準診斷和個體化治療提供了很大的助力[5]。

ctDNA指惡性腫瘤體細胞DNA經脫落或者當細胞凋亡后釋放進入循環系統的小片段DNA，可以出現與原發腫瘤DNA相同特征或基因改變：如點突變、超甲基化、微衛星不穩定性（MI）、雜合性缺失（LOH）等多種類型的基因修飾變異[6]。前瞻性研究表明，外周血ctDNA與腫瘤組織相比，其EGFR基因突變的檢測同樣具有較高特異度，靈敏度有待提高。外周血ctDNA檢測出EGFR突變陽性的患者接受吉非替尼治療后，較標準化學治療的患者客觀緩解率明顯提高，無進展生存期明顯延長[12]。因此，中國NSCLC患者EGFR基因突變檢測專家組認為，當腫瘤組織難以獲取時，外周血ctDNA可作為EGFR基因突變檢測的合理替代選擇，并寫入了2016年專家共識[4]。

MRE是晚期NSCLC患者常見合并癥之一。在腫瘤組織難以獲取時，胸腔積液可以作為細胞學檢測的替代。但由于胸腔積液標本易受采集分離等種種因素干擾，其在EGFR基因突變檢測效能報道不一。國內禹樂等[7]應用實時熒光定量PCR的方法檢測發現，同一患者的胸腔積液細胞中提取的DNA質量與組織標本相近，濃度卻普遍略低，但檢測的總體EGFR突變率相近。趙士偉等[8]用ADxARMS方法檢測了胸腔積液和肺癌組織標本的EGFR基因突變率，也發現兩者比較差異無統計學意義。

胸腔積液與外周血ctDNA在NSCLC患者EGFR基因突變檢測方面孰優孰劣還沒有定論。由于循環中存在的ctDNA極其微量，對檢測技術提出了很高的要求。NGS一次可以針對幾十萬至幾百萬條DNA分子進行序列測定，所需的DNA樣本量極少，適用于ctDNA這種微量DNA的檢測，在腫瘤診斷方面表現出較高的靈敏度和特異度。Couraud等[9]用NGS技術檢測了68例晚期NSCLC患者配對腫瘤組織的外周血ctDNA，結果顯示外周血ctDNA含量與分期和轉移灶數目相關，其相比組織檢測的靈敏度為58%，特異度為87%。Newman等[10]應用NGS技術檢測NSCLC患者血漿ctDNA，發現在Ⅱ～Ⅳ期的患者中，檢測靈敏度達100%，Ⅰ期患者的靈敏度為50%，而各期肺癌患者的特異度均為96%。NGS技術從而也被公認為是檢測ctDNA的“金標準”[11]。

本研究通過NGS技術檢測晚期NSCLC患者胸腔積液及配對外周血中的ctDNA，并進行多基因聯合檢測以及對比分析，比較兩者間的差異。結果發現，以外周血ctDNA檢出的基因突變結果為金標準，胸腔積液ctDNA對NSCLC基因突變的靈敏度為86%～100%，特異度達94%～100%，與外周血ctDNA結果的總體符合率為95%～100%。其中，有1例患者外周血ctDNA中未檢出突變，但相應胸腔積液ctDNA中則檢測出EGFR exon 21號外顯子L858R點突變，為應用EGFRTKI提供了良好的依據。在檢測耐藥突變基因T790M方面，兩者也達到了一致。而在檢測豐度方面，胸腔積液ctDNA檢測出的突變豐度高于其對應的外周血ctDNA。究其原因，可能系胸腔積液中脫落出的腫瘤細胞片段DNA較釋放入血的更多，更易被檢測到。

外周血ctDNA作為液體活檢的重要組成，可以說是一種新型的腫瘤標記物，可實時反映出惡性腫瘤發生、發展過程中基因異常的動態變化，且與組織活檢標本相比，具有操作簡便、損傷小、患者易接受、可反復取材等優勢。本研究顯示，用NGS技術亦能檢測出微量的胸腔積液ctDNA，與外周血相比，具有相同的檢測效能，甚至檢測豐度更高，從而為NSCLC患者的EGFR基因突變檢測開辟了新途徑。胸腔積液和外周血ctDNA的檢測及其生物學指標的研究，將有可能為晚期NSCLC患者的診斷、預后判定及跟蹤隨訪等提供一系列方便、快捷、特異、無創或微創的分子生物學檢測手段。

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（收稿日期：20170801）

（本文編輯：林燕薇）