CCR5第一和第二胞外環特異性結合短肽對大鼠結腸炎的炎癥細胞浸潤及NF撥蔅/TNF撥列藕磐路的影響

宋楊達 劉思雪 宋銥航 沈溪明 黃花榮 鐘英強

【摘要】目的研究CC趨化因子受體5（CCR5）第一和第二胞外環特異性結合短肽對三硝基苯磺酸（TNBS）誘導的SD大鼠結腸炎的炎癥細胞浸潤及NFκB/TNFα信號通路的影響。方法采用5%TNBS構建大鼠結腸炎模型，分別給予2種CCR5短肽干預，通過病理細胞學分析、蛋白免疫印跡法、PCR等方法分別評估其組織學、基因及蛋白質水平的變化。結果與模型組相比，2組給予CCR5拮抗短肽的大鼠均表現為結腸炎組織學損傷減輕（P均<005），鏡下可見中性粒細胞、淋巴細胞及巨噬細胞浸潤減少（P均<005）。同時，NFκB/TNFα信號通路相關的蛋白及mRNA表達水平也較之模型組明顯下降（P均<005）。結論特異性結合CCR5第一和第二胞外環的短肽可明顯抑制TNBS誘導的SD大鼠結腸炎癥，其機制可能是通過抑制NFκB/TNFα信號通路的激活。

【關鍵詞】CC趨化因子受體5；拮抗肽；炎癥性腸病；核轉錄因子κB；腫瘤壞死因子α

Effects of antagonistic peptides specifically binding to the first and second extracellular loops of CCR5 on inflammatory cell infiltration and NFκB/TNFα signaling pathway in rats colitisSong Yangda， Liu Sixue， Song Yihang， Shen Ximing， Huang Huarong， Zhong Yingqiang Department of Gastroenterology， Sun Yatsen Memorial Hospital， Sun Yatsen University， Guangzhou 510120， China

Corresponding author， Zhong Yingqiang， Email： zhongyingqiang@126com

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of the specific binding of antagonistic peptides to the first and second extracellular loops of CC chemokine receptor 5（CCR5） upon the inflammatory cell infiltration and NFκB/TNFα signaling pathway in SD rats with colitis induced by trinitrobenzene sulfonic acid （TNBS） MethodsThe experimental SD rat models with colitis were induced by 5% TNBS， and intervened by two antagonistic peptides of CCR5 Pathological cytological analysis， western blot and PCR were performed to examine the histological changes of colon， proteins and mRNA levels of the NFκB/TNFα signaling pathway Results Compared with model group， the histological injuries of colitis were alleviated after administration of two antagonistic peptides of CCR5 （both P<005） The infiltration of neutrophils， lymphocytes and macrophages in rats treated with GH and HY peptides was significantly reduced （all P<005） Besides， the expression levels of the proteins and mRNAs related to the NFκB/TNFα signaling pathway were also significantly downregulated （all P<005） ConclusionsAntagonistic peptides specifically binding to the ECL1 and ECL2 of CCR5 can evidently inhibit the inflammation in SD rats with TNBSinduced colitis， probably by suppressing the activation of the NFκB/TNFα signaling pathway

【Key words】CC chemokine receptor 5； Antagonistic peptide； Inflammatory bowel disease；

Nuclear factorκB； Tumor necrosis factorα

炎癥性腸病（IBD）是一組慢性腸道非特異性免疫炎癥性疾病，其病理生理的本質是在腸道中有大量的各種炎癥細胞浸潤以及由其引發的各種炎癥因子的釋放，造成腸道黏膜的損傷與上皮細胞修復并存。CC趨化因子受體5（CCR5）是趨化因子受體的一種，其可調節各種細胞因子的產生，促使多種炎癥細胞的趨化與激活，在IBD、哮喘、類風濕性關節炎等多種自身免疫性疾病的發病過程中發揮重要的作用[15]。核轉錄因子κB（NFκB）作為炎癥與免疫反應的重要調控因子，同樣參與了IBD的病理生理發展過程[6]。在我們前期的研究中發現，CCR5與IBD密切相關，在活動期IBD腸黏膜中高表達，并采用噬菌體肽庫展示技術，已成功篩選出2條分別與CCR5第一、第二胞外環特異性結合的生物活性模擬肽[78]。本研究在此基礎上進一步研究這兩條短肽對三硝基苯磺酸（TNBS）誘導的大鼠結腸炎的炎癥細胞浸潤及NFκB/TNFα信號通路的影響。

材料與方法

一、實驗動物

健康成年雌性SpragueDawley（SD）大鼠40只，重量（200±20）g，購自中山大學實驗動物中心，動物實驗倫理批準編號為IACUCDB160313，飼養條件為SPF級。

二、主要試劑與儀器

5%TNBS購自Sigma公司；Trizol RNA提取試劑盒、Premix Taq PCR試劑盒及Realtime PCR試劑盒購自Takara公司；NFκB通路抗體試劑盒[包括兔抗鼠IKKβ， PhosphoIKK α/β（Ser176/180）， p65， Phosphop65（Ser536）， IκBα以及PhosphoIκBα（Ser32）抗體]購自Cell Signaling Technology公司；兔抗鼠TNFα，βactin抗體購自Novus公司；CCR5第一、第二胞外環的兩條活性模擬短肽由上海吉爾生化有限公司合成，純度為95%，其序列分別為GHWKVWL（簡稱GH），HYIDFRW（簡稱HY）。實時熒光定量PCR儀（Light Cycler96）。

三、方法

1實驗分組

SD大鼠在經過1周的適應性飼養后，隨機分為以下4組：正常對照組（Normal組）、模型組（Model組）、GH短肽治療組（GH組）、HY短肽治療組（HY組）。

2IBD動物模型的建立

在經典的TNBS造模方法的基礎上稍加改動[9]。具體方法大致為：造模前大鼠禁食不禁水24 h，10%水合氯醛麻醉，經石蠟油潤滑后，將16號大鼠灌胃針由肛門輕輕插入腸腔約8 cm，緩慢灌入預先配好的灌腸液（按大鼠100 mg/kg的TNBS與等體積乙醇混合而成），灌入完畢后保持大鼠倒置5 min，然后將大鼠以頭低尾高約呈30°的體位放回于籠中墊料上，自然蘇醒，恢復自由飲食。本實驗方案經中山大學實驗動物管理與使用委員會以及實驗動物倫理委員會的批準。

3給藥與取材

在經TNBS造模后的第3日，2個治療組分別經大鼠尾靜脈給予GH短肽（35 mg/kg）和HY短肽（25 mg/kg），而正常對照組和模型組的大鼠則用尾靜脈注射09%生理鹽水代替。給藥時間為每日1次，連續7 d給藥。給藥濃度的選擇則是根據我們先前的實驗結果[10]。在TNBS造模后的第14日，通過10%水合氯醛以腹腔注射過量麻醉藥處死大鼠，取大鼠全結腸，沿腸系膜剪開后，用預冷生理鹽水清洗。之后在模型及治療組的病變邊緣處和正常對照組的對應腸段取材，所取組織一部分用于病理學檢測；另一部分于-80°冰箱保存，用于后續的分子生物學檢測。

4組織學評價

新鮮組織4%多聚甲醛固定過夜，石蠟包埋，切片（厚度為5 μm），蘇木素伊紅染色后，在顯微鏡下觀察。鏡下的評價內容包括潰瘍、炎癥程度和范圍以及炎癥細胞的計數。納入計數的炎癥細胞包括中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞以及巨噬細胞，計數方法為在×400高倍鏡下隨機選取10個獨立視野，統計上述各炎癥細胞的數目。

5蛋白提取與蛋白免疫印跡法

總蛋白通過RIPA裂解液提取。通過BCA法測定蛋白濃度后，將等量的蛋白樣本與相應體積的loading buffer相混合成20 μl體系，加入SDSPAGE凝膠中電泳（初為恒壓60 V，后為恒壓110 V），再轉膜至PVDF膜上（恒流250 mA，100 min，PVDF膜孔徑為045 μm）。接著放入5%脫脂牛奶中室溫封閉1 h，后加入相應的一抗（抗體稀釋比例均為1∶1 000），4℃過夜。第2日經過TBST洗膜后，加入二抗（抗體稀釋比例為1∶5 000）室溫孵育1 h。最后通過ECL化學發光法顯影，并拍照保存結果。條帶結果分析通過ImageJ軟件進行灰度值分析比較。以βactin作為總蛋白的內參。

6實時逆轉錄PCR

通過Trizol法提取結腸組織總RNA，然后通過逆轉錄試劑盒，合成cDNA。接著加入目標基因相對應的引物（引物序列見表1），對各目標基因進行PCR擴增，通過檢測相結合SYBR染料的信號，得到對應的循環數Ct值。PCR的反應體系為：1 μl cDNA、5 μl 2×Sybr Green Premix Ex Taq試劑、04 μl正向引物和04 μl反向引物，無菌雙蒸水補足至10 μl。PCR擴增參數為：95℃30 s，95℃5 s，60℃ 20 s，40個循環。內參基因為βactin。最后結果的分析計算采用2ΔΔCt法計算各基因表達的相對變化[11]。

表1RTPCR的引物序列大鼠基因引物（53）βactinF： GGGAAATCGTGCGTGACATTR： GCGGCAGTGGCCATCTCp105F： GATGGGACGACACCTCTACACATAR： CCCAAGAGTCGTCCAGGTCAp100F： CTGATGGCACAGGACGAGAAR： TGGGCTATCTGCTCAATGACACp65F： CGACGTATTGCTGTGCCTTCR： TTGAGATCTGCCCAGGTGGTAI kappa B激酶F： TACGGTCCCAATGGCTGTTT（IKK）R： GGTATGTGTGAATGGTGCCTGTTNFαF： TGGCGTGTTCATCCGTTCTCTACR： CTACTTCAGCGTCTCGTGTGTTTC四、統計學處理

統計學分析采用SPSS 220。計量數據以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSDt檢驗。P<005為差異有統計學意義。

結果

一、CCR5短肽對大鼠結腸炎的組織學和炎癥細胞浸潤的影響

在顯微鏡下，與正常對照組相比，模型組可觀察到潰瘍形成，上皮缺損，隱窩損傷，以及累及結腸黏膜全層的嚴重的炎癥反應，并伴隨著大量的中性粒細胞和淋巴細胞浸潤，以及一定數量的巨噬細胞和嗜酸性粒細胞浸潤（圖1A、B）。在GH短肽治療組和HY短肽治療組中，炎癥則主要局限于黏膜和黏膜下層（圖1C、D），并且與模型組相比，2個短肽治療組均表現為不同程度的中性粒細胞、淋巴細胞和巨噬細胞浸潤程度減少（P均<005），但嗜酸性粒細胞則無明顯變化。另外，GH短肽治療組和HY短肽治療組各炎癥細胞的數量比較差異并沒有統計學意義。各炎癥細胞計數的結果見表2。

二、CCR5兩短肽對NFκB/TNFα信號通路相關蛋白的影響

4組間pIKKα、pp65、IκBα、pIκBα、TNFα比較，差異有統計學意義（F值分別為1108、22340、969、3178、25210，P均<001）。其中，與正常對照組相比，模型組大鼠pIKK，pp65，pIκBα和TNFα蛋白水平分別約為正常對照組的13倍、20倍、17倍和17倍，而IκBα蛋白水平則下降（P均<005），提示模型組IκBα的降解和NFκB通路的顯著激活。與此相反，與模型組相比，GH或HY短肽治療均可不同程度地引起pIKK、pp65、pIκBα和TNFα蛋白水平的下降。而短肽治療組和正常對照組的IκBα水平差異則沒有統計學意義，提示短肽治療組可抑制IκBα的降解。另外，4個組的IKK和p65的蛋白水平差異均沒有統計學意義（F值分別為258和301，P均>005，見圖2）。

三、CCR5短肽對NFκB/TNFα信號通路相關基因的影響

通過Real timePCR測定了包括了p105、p100、p65、IKK和TNFα在內的NFκB/TNFα通路相關基因的相對表達水平（圖3）。4組間p105、p100、IKK和TNFα比較，差異有統計學意義（F值分別為34380、2992、30151和1998，P均<001）。其中，從圖中可知，模型組大鼠p105、p100、IKK以及TNFα的mRNA水平較之正常對照組升高（P均<001），分別約為正常對照組的160倍、38倍、80倍和68倍。與此相反，GH組和HY組的大鼠p105、p100、IKK以及TNFα的mRNA水平較之模型組則出現了下降（P均<001）。另外，4組之間p65的mRNA表達水平差異沒有統計學意義（F=313，P>005）。

討論

CCR5是一種G蛋白偶聯受體，在結構上包含一個N末端，3個胞外環（分別為ECL1，ECL2和ECL3），七次跨膜的α螺旋結構域，3個胞內環，以及胞內的C端，其中胞內區的羧基末端含絲氨酸/蘇氨酸，可發生磷酸化，從而與G蛋白相偶聯，參與MAPK、JAKSTAT、NFκB等信號轉導通路的調控[12]。

在哺乳動物中，NFκB家族主要由5種蛋白組成，包括RelA（即p65）、cRel、RelB、NFκB1（p105/p50）和NFκB2 （p100/p52）。其中p105和p100分別為p50和p52的前體。這5種蛋白可任意兩兩組合成同源二聚體或異源二聚體，但以p50p65異二聚體最為常見[13]。在靜息狀態下，NFκB與抑制性蛋白IκB緊密結合，以無活性狀態存在于細胞質當中。在炎性信號的刺激下（如TNFα， LPS， IL1等），IKK可被激活。接著IKK催化IκB發生磷酸化，進而IκB可被泛素標記，從而被轉運到蛋白酶體發生降解，釋放出游離的NFκB。之后，游離的NFκB便可通過核孔復合物在核轉位序列的介導下轉位入核，對多種炎癥與免疫相關基因（包括IL1β和TNFα等）的轉錄發揮調控作用[14]。

迄今為止，已有許多研究探索了CCR5與IBD之間的關系。有研究發現，TAK779（一種非肽類小分子CCR5拮抗劑）可緩解葡聚糖硫酸鈉誘導的動物結腸炎，抑制單核/巨噬細胞的浸潤和促炎因子如IL1β和IL6的產生[15]。在人類IBD的研究中也發現了相似的結果：CCR5在人類IBD患者的腸黏膜中高度表達，且表達量與疾病的活動度相關[7]。這些實驗的研究結果均提示了CCR5在IBD發病過程中所扮演的重要角色，同時也提示了抑制CCR5可成為IBD治療的新思路。

時至今日，已有多種CCR5抑制劑被開發，主要包括趨化因子修飾衍生物，非肽類小分子化合物，單克隆抗體和短肽類化合物[15]。其中本研究所采用的短肽類拮抗劑，它可與CCR5受體的胞外結構高度特異性結合，親和力及安全性均較高，生產成本較低等優勢。因此，我們通過噬菌體肽庫展示技術篩選并合成了兩條特異性結合CCR5胞外環的短肽，并探究了它們在大鼠結腸炎中的治療效果[8]。

本研究發現，與模型組相比，2個短肽治療組均出現不同程度炎癥明顯范圍縮小，中性粒細胞、淋巴細胞和巨噬細胞浸潤程度的明顯下降。既往研究已發現CCR5廣泛表達于樹突狀細胞、單核/巨噬細胞、中性粒細胞以及效應和調節性T細胞等細胞膜的表面。結合這些研究結果，本研究表明CCR5與結腸炎的中性粒細胞、淋巴細胞和巨噬細胞遷移浸潤作用密切相關，而特異性結合CCR5胞外第一、第二環的兩條短肽可在一定程度上抑制上述炎癥細胞的浸潤作用，減輕組織學損傷。

接下來，蛋白免疫印跡法和PCR的結果進一步證實了GH和HY短肽對NFκB/TNFα通路的抑制作用，主要表現為抑制IKK、p65以及IκBα的磷酸化，減少p100、p105、IKK和TNFα的表達，但是p65的總蛋白水平在各組之間并無差異。此前提到，p50p65異二聚體在與IκB解離后，可通過核孔復合物在NTS的介導下轉位入核，故NFκB通路激活時，p65的總蛋白水平可保持不變，而表現為核內的p65水平升高，因而也解釋了本實驗中p65的總蛋白水平在各組之間無差異的結果。另外p65基因的表達在4組之間也沒有明顯差異，也提示了p65基因表達的穩定性以及可能存在著其他對NFκB通路調節的機制。

值得注意的是，不管是在組織學、蛋白抑或是基因水平，2條短肽GH和HY組之間都沒有發現統計學差異。關于CCR5受體的功能性結合位點，不同的研究有不同的觀點。早期關于CCR5與HIV1如何入侵CD4+T細胞的研究發現CCR5受體的N端和第二個胞外環（即ECL2）在HIV1共受體功能中發揮重要作用。而在2013年，Schnur等通過MRI技術繪制并研究了CCR5各胞外結構與其天然配體RANTES相結合的位點和親和力。就單一結構而言，N端和ECL2與RANTES的親和力更高。但是ECL1ECL2共同體與RANTES的親和力明顯強于ECL2單體。這是由于只有ECL1存在時，ECL2才能保持更穩定的構象。也就是說，不管是阻斷ECL1還是ECL2中的任意一個，都可以導致CCR5與配體的結合力下降。另外，這一發現也提示了同時阻斷ECL1和ECL2可能可以更好地抑制CCR5的功能。

因此，本研究的結果表明CCR5第一、第二胞外環特異性結合的拮抗短肽可通過抑制NFκB/TNFα信號通路，抑制TNBS誘導的大鼠結腸炎的炎癥細胞的浸潤，減輕組織學損傷，所以，CCR5拮抗短肽也許可以成為IBD治療的新方法。通過進一步的研究和探索2條短肽的藥物代謝動力學特點以及兩者是否具有協同作用，將有助于未來CCR5拮抗短肽的臨床應用。

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（收稿日期：20180108）

（本文編輯：楊江瑜）