鮮生地黃對慢加急性肝衰竭大鼠JAK2/STAT3通路的影響

郭麗穎 李秋偉 李力

摘要目的：觀察鮮生地黃對慢加急性肝衰竭大鼠JAK2/STAT3通路的影響。方法：30只雄性Wistar大鼠按照1∶4比例隨機分為對照組和實驗組。實驗組大鼠先用四氯化碳誘導成肝纖維化模型，再按照1∶1比例隨機分為模型組和觀察組，應用D氨基半乳糖進行急性攻擊，建立慢加急性肝衰竭大鼠模型。觀察組在急性攻擊前7 d予以鮮生地黃連續灌胃。各組大鼠分別在急性攻擊后24 h取材，檢測血清內毒素、白細胞介素6含量及肝臟組織中JAK2mRNA、STAT3mRNA的表達。結果：模型組大鼠肝組織中JAK2mRNA、STAT3mRNA表達低于對照組和觀察組，差異有統計學意義（P<005）。觀察組與對照組大鼠肝組織中JAK2mRNA、STAT3mRNA表達差異無統計學意義（P>005）。模型組大鼠血清內毒素顯著高于對照組和觀察組，差異有統計學意義（P<001）;觀察組與對照組比較，大鼠血清內毒素表達差異無統計學意義（P>005）。模型組大鼠血清白細胞介素6高于對照組和觀察組，但差異無統計學意義（P>005）。結論：鮮生地黃能夠降低腸道內毒素的吸收，促進JAK2/STAT3通路活化，但是介導物質可能并不是IL6，相關機制需要進一步完善。

關鍵詞鮮生地黃;慢加急性肝衰竭;JAK2;STAT3

Effects of Fresh Radix Rehmanniae Recens on JAK2/STAT3 Pathway in Acuteonchronic Liver Failure Rats

Guo Liying1，2，Li Qiuwei1，2，Li Li1，Miao Jing2，Jia Jianwei2

（1 Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China; 2 Tianjin Second People′s Hospital，Tianjin 300192，China）

AbstractObjective：To observe the effect of fresh Radix Rehmanniae Recens on JAK2/STAT3 pathway in acuteonchronic liver failure rats.Methods：Thirty male Wistar rats were randomly divided into control group and experimental group according to 1∶4 ratio.Rats in experimental group were firstly induced to hepatic fibrosis model with carbon tetrachloride，and then randomly divided into model group and treatment group according to the ratio of 1∶1.Acute attacks were performed with Dgalactosamine and a rat model of chronic acute liver failure was established.The treatment group was given intragastrically with the fresh Radix Rehmanniae Recens 7 days before the acute attack.Rats in each group were harvested 24 hours after acute challenge.Serum endotoxin，interleukin6 levels，and expression of JAK2 mRNA and STAT3 mRNA in liver tissue were measured.Results：The expression of JAK2 mRNA and STAT3 mRNA in the liver tissue of the model group was lower than that in the control group and the model group.The difference was statistically significant （P<005）.There was no significant difference in the expression of JAK2 mRNA and STAT3 mRNA between the treatment group and the control group （P>005）.The serum endotoxin level in the model group was obviously higher than that in the control group and the treatment group，and the difference was statistically significant （P<001）.There was no significant difference in serum endotoxin expression between the treatment group and the control group （P>005）.Serum interleukin6 levels in the model group were higher than those in the control group and the treatment group，but the difference was not statistically significant （P>005）.Conclusion：Fresh Radix Rehmanniae Recens can reduce the absorption of toxins in the intestine and promote the activation of JAK2/STAT3 pathway，but the mediator may not be IL6，and the relevant mechanisms need to be further improved.

Key WordsFresh Radix Rehmanniae Recens; Chronic plus acute liver failure; JAK2; STAT3

中圖分類號：R7433文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.08.039

肝衰竭屬于中醫學“急黃”“瘟黃”范疇，“濕、熱、瘀”是肝衰竭的主要病理基礎，“毒、虛”是肝衰竭的特有病理因素，“熱、毒”是疾病進展的關鍵[1]。鮮生地黃既可以清熱涼血，又可以養陰生津，因此它可以作用于肝衰竭的多個病理過程，在臨證中獲得一定的療效[24]，但是其作用機制尚不明確。酪氨酸激酶2（JAK2）/轉錄因子3（STAT3）信號通路是肝損傷發展過程中的重要調控機制。因此本研究基于JAK2/STAT3通路，初步探討鮮生地黃治療肝衰竭的可能作用機制。

1材料與方法

11材料

111實驗動物清潔級雄性Wistar大鼠30只，質量（220±20）g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司（動物許可證號：SCXK2016006）。實驗前在恒溫（25 ℃）、光照周期12 h/12 h環境中適應性飼養1周。

112藥物鮮生地黃生地黃采自河南省武陟縣，清洗后真空冰凍保鮮技術處理，用前榨汁。

113試劑與儀器

1131主要試劑TRNzol總RNA提取試劑由天根生化科技（北京）有限公司，生產批號：DP40502。PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser由TaKaRa生物有限公司，生產批號：RR047B。Premix Ex TaqTM（探針法mix）由TaKaRa生物有限公司，生產批號：RR390L。所用的JAK2、STAT3目的基因引物、探針均由北京Invitrogen公司合成。D氨基半乳糖（DGal）購自上海市阿達瑪斯試劑有限公司，批號：P1243553。四氯化碳（CCl4）購自天津市化學試劑供銷公司，批號：160918。橄欖油購自天津市化學試劑供銷公司，批號：161205。

1132主要儀器QL902渦旋振蕩儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）;Centrifuge 5415D離心機（Eppendorf公司）;分光光度NANODROP 2000（Therno scientific公司）;凝膠成像系統Tanon 1600（上海天能科技有限公司）;熒光定量PCR儀ABI7500（Applied Biosystems公司）;ELX800型酶標儀（美國BIOTEK公司）。

12方法

121分組與模型制備

1211動物模型制備參考樸正福、張海燕等[56]方法建立慢加急性肝衰竭大鼠模型。

1212肝纖維化大鼠模型制備將CCl4與橄欖油按照1∶1配制成50%CCl4橄欖油溶液，按照2 mL/kg劑量，給予大鼠腹腔注射，1次/3 d，連續8周，建立肝纖維化大鼠模型。

1213慢加急性肝衰竭大鼠模型制備DGal與09%氯化鈉溶液按照1∶10配制成DGal溶液。肝纖維化模型大鼠禁食24 h，不禁水，按照2 g/kg劑量，腹腔注射DGal溶液，建立慢加急性肝衰竭大鼠模型。

1214分組采用SPSS 220統計軟件進行隨機化處理。30只Wistar大鼠按照1∶4比例隨機分為2組，空白對照組（簡稱對照組）6只，自由飲水進食;實驗組24只，自由飲水進食，并按照1212方法應用50%CCl4橄欖油溶液建立肝纖維化模型。8周后從實驗組中隨機抽取6只大鼠驗證肝纖維化模型成立后，余下的大鼠按照1∶1比例隨機分為模型組和觀察組，按照1213方法應用DGal進行急性攻擊，建立慢加急性肝衰竭大鼠模型。

122給藥成模前1周開始進行藥物干預。對照組、模型組按照025 mL/100 g劑量給予生理鹽水灌胃，1次/d;觀察組按照025 mL/100 g劑量給予鮮生地黃汁灌胃，1次/d。取材：慢加急性肝衰竭大鼠模型成立24 h后，麻醉解剖大鼠，采集門靜脈血液，于3 000 r/min離心10 min后留取上清，液氮保存后轉移到-80 ℃冰箱凍存，待測;取肝左葉組織液氮保存后轉移到-80 ℃冰箱凍存，待測。

123檢測指標與方法

1231一般情況觀察每天記錄各組大鼠飲食量及體重，觀察皮毛及大便情況。

1232血清內毒素、IL6檢測采用酶聯免疫吸附法進行檢測。往預先包被的內毒素（ET）、白細胞介素6（IL6）捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體，經過溫浴并徹底洗滌，用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉化為藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和ET、IL6呈正相關。用酶標儀在450 nm波長測定吸光度，計算樣品濃度。

1233肝組織中JAK2、STAT3的mRNA檢測采用Real Time PCR taqman探針方法檢測目的基因mRNA，以GAPDH為內參照，雙標準曲線法進行相對定量。肝臟組織放入已預冷的研缽中進行研磨成粉末狀，按TRNzol總RNA提取試劑說明書提取RNA，并應用紫外吸收測定法檢測濃度和純度。然后采用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser進行cDNA反轉錄。取cDNA樣品配置Realtime PCR反應體系進行PCR反應。PCR反應體系為20 μL，Master Mix（2×）10 μL，上下游特異引物各05 μL，探針05 μL。PCR反應條件：95 ℃孵育30 s，然后95 ℃延伸5 s重復循環39次，末次循環60 ℃延伸至40 s，收集熒光。JAK2引物序列（5′to3′）：上游TATGCGAATGATCGGCAATG，下游AAATCTCGTCTGGGCACCCT，探針FAMAAGGGCAGATGATCGTATTCCATTTBHQ1;STAT3引物序列（5′to3′）：上游TGATAAGGACTCTGGGGATG，下游GGGTCAGGTGCTTGAACTCT，探針FAMCCTCAGAGGGTCTCGGAAATTTAACBHQ1。其中Reporter為FAM，Quencher為BHQ1。目的基因和內參分別進行Realtime PCR反應，每個樣本檢測3個復孔。數據采用2△△ CT法進行分析。每一份標本均行復管檢測，取其均值做為目的基因的表達水平。

13統計學方法采用SPSS 220統計軟件進行數據分析，行正態性檢驗和方差齊性檢驗，所有數據均以均數±標準差（±s）表示，符合正態分布且方差齊的數據應用單因素方差分析LSD檢驗;呈偏態分布或方差不齊則作多組樣本秩和kw檢驗。以P<005為差異有統計學意義。

2結果

21一般情況比較對照組大鼠毛發光澤，活動多，精神狀態好，大便正常。實驗組大鼠在給予CCl4過程中，毛發凌亂無光澤，易急惹，皮膚逐漸黃染，體重增長緩慢。8周時實驗組大鼠死亡2只，隨機抽取6只大鼠中解剖發現有2只出現腹水。DGal急性攻擊后，模型組和觀察組大鼠逐漸出現精神萎靡，黃疸加重，部分可見口鼻出血癥狀，至24 h模型組死亡1只。

22肝組織JAK2mRNA、STAT3mRNA表達3組大鼠肝組織中JAK2mRNA、STAT3mRNA表達差異有統計學意義（P<001）。對照組及觀察組大鼠肝組織中JAK2mRNA、STAT3mRNA表達均高于模型組，差異有統計學意義（P<001）。對照組與觀察組比較，大鼠肝組織中JAK2mRNA、STAT3mRNA表達差異無統計學意義（P>005）。見表1。

3討論

肝衰竭是多種病因所致的嚴重肝臟損害，導致其合成、解毒、排泄和生物轉化等功能發生嚴重障礙或失代償，出現以凝血功能障礙、黃疸、肝性腦病、腹水等為主要表現的一組臨床征候群，預后差，病死率高，是肝臟病中常見的危重病。肝衰竭發病機制可以概括為免疫損傷、缺血缺氧損傷、內毒素血癥“三重打擊學說”[7]，核心表現在肝細胞死亡、炎性反應細胞浸潤和微循環障礙三方面，其中肝細胞大量壞死及有效再生的缺乏是肝衰竭死亡的主要原因[8]。因此肝細胞的有效再生，是改善肝衰竭預后的重要因素。酪氨酸激酶JAK/轉錄因子STAT參與了許多細胞因子及生長因子介導的細胞增殖及分化等生物過程，特別是STAT蛋白已被證實在細胞因子誘導細胞增殖過程中占有重要地位，其中JAK2/STAT3通路在成人肝臟中表達，并參與肝再生、免疫等過程[910]。研究[11]表明在肝臟局部切除術后多種早期即刻基因被立即激活。IL6負責激活這些基因的40%。IL6可活化STAT，許多研究表明這就是肝再生的開始[12]。

鮮生地黃甘寒質潤，養陰生津同時又可清熱涼血，將其應用于肝衰竭治療中可涼血解毒、清營護絡;可增水濡絡而行血;調和陰陽，生津養液，滋補肝腎，整體作用于肝衰竭“三重打擊學說”中的各個階段。現代研究[1314]表明中藥養陰生津作用主要體現在調控細胞增殖方面。為進一步明確鮮生地黃作用機制，我們探討了鮮生地黃對JAK2/STAT3通路影響。

本研究證實了鮮生地黃能夠提高慢加急性肝衰竭大鼠模型中肝組織中JAK2mRNA、STAT3mRNA的表達（P<005），達到正常大鼠水平（P>005）;能夠降低慢加急性肝衰竭大鼠模型門靜脈ET水平（P<005），但是不能改善早期免疫損傷所致的IL6升高的結局（P>005）。因此我們推測鮮生地黃能夠降低腸道內毒素的吸收，能夠促進JAK2/STAT3

通路活化，但是介導物質并不是IL6，相關機制需要進一步完善。

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（2018-04-17收稿責任編輯：王明）