基于Wnt通路加味烏梅丸對(duì)結(jié)腸癌的抑制機(jī)制

張然　李素娟　陳正彥

摘要目的：探討加味烏梅丸抑制結(jié)腸癌的效果并分析其作用機(jī)制。方法：選取BALB/c雄性小鼠30只，隨機(jī)分為空白組、模型組和烏梅丸組，每組10只。其中空白組小鼠不接受干預(yù)措施，烏梅丸組進(jìn)行烏梅丸煎劑灌胃處理，空白組及模型組接受等劑量生理鹽水灌胃，均干預(yù)28 d，觀察腫瘤體積的變化、小鼠的體重及存活率、腫瘤組織Wnt、JNK水平變化。結(jié)果：模型組與烏梅丸組小鼠腫瘤體積較干預(yù)前均有增加的趨勢(shì)，其中烏梅丸組增加的速度較慢，并在干預(yù)28 d后腫瘤組織有減小的趨勢(shì)；干預(yù)28 d空白組小鼠體重與初始體重相近，模型組及烏梅丸組小鼠體重明顯下降，其中模型組較烏梅丸組下降明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005）；干預(yù)結(jié)束后模型組僅有4只小鼠存活，而烏梅丸組有7只小鼠存活，存活率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005）。模型組及烏梅丸組小鼠腫瘤組織Wnt、JNK蛋白及mRNA均過(guò)表達(dá)，其中模型組Wnt、JNK表達(dá)水平明顯高于烏梅丸組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005）。結(jié)論：加味烏梅丸具有明顯抑制結(jié)腸腺瘤惡化作用，其抗腫瘤機(jī)制可能與抑制Wnt通路表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞結(jié)腸癌；烏梅丸；腫瘤體積；Wnt蛋白；JNK蛋白；抗腫瘤；侵襲能力；療效

Mechanism Exploration of Modified Wumei Boluses on Colon Cancer Inhibition via Wnt Pathways

Zhang Ran， Li Sujuan， Chen Zhengyan， Yang Kun

（Department of Spleen， Stomach， Liver and Gallbladder， Henan University of Traditional Chinese Medicine， Zhengzhou 450000， China）

AbstractObjective：To investigate the colon cancer inhibition of modified wumei boluses and to analyze some of the action mechanism. Methods：A total of 30 BALB/c male mice were randomly divided into blank group， model group and wumei boluses group， with 10 in each group. The mice of blank group did not accept intervention measures， and wumei boluses group had lavage treatment of wumei boluses decoction. Blank group and model group received isodose physiological saline lavage. All the groups had 28 d intervention. The changes of tumor volume， weight of mice and survival rate， concentration changes of Wnt， JNK in the tumor tissue were observed. Results：1）the mice tumor volume increased in the model group and wumei boluses group than before the intervention， and the increase in the wumei boluses group was more slowly. The tumor tissue had a tendency to decrease after 28 d of intervention. 2）After 28 days of the intervention， the mice weight in the blank group was similar to the initial weight， and the mice weight of the model group and the wumei boluses decreased obviously. The decrease of model group was more significantly than that in the wumei boluses group （P<005）； After the intervention， only 4 mice survived in the model group， and 7 mice survived in the wumei boluses group. The survival rate differences between the two groups were statistically significant （P<005）. 3）Protein and mRNA of Wnt， JNK in mice tumor tissue of both the model group and wumei boluses group showed high expression， and expression levels of Wnt， JNK in the model group was obviously higher than that of wumei boluses group （P<005）. Conclusion：The modified wumei boluses has obvious inhibitory effect on deterioration of colonic adenoma， and the mechanism of antitumor may related to the inhibition on the expression of Wnt pathways.

Key WordsColon cancer； Wumei boluses， Wnt； JNK； Antitumor； Invasiveness； Curative effect

中圖分類號(hào)：R2895；R7353文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.08.038

結(jié)腸癌是臨床常見的消化道惡性腫瘤，隨著人們生活方式以及飲食結(jié)構(gòu)的改變，結(jié)腸癌的發(fā)病率日益增加，發(fā)病年齡亦有年輕化趨勢(shì)[12]。有研究顯示結(jié)腸癌從良性病變轉(zhuǎn)變成癌前病變，最終發(fā)展成惡性病變過(guò)程中Mnt信號(hào)通路被異常激活[3]。Mnt信號(hào)通路與機(jī)體正常胚胎發(fā)育密切相關(guān)，該通路的標(biāo)志蛋白相互影響，從而介導(dǎo)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，是結(jié)腸癌發(fā)生的關(guān)鍵因素之一，因此，抑制Mnt通路的活化是治療結(jié)腸癌的靶方向。烏梅丸源自《傷寒論》，既往該方被視為此方為止痛安蛔的要方，隨著醫(yī)藥研究的逐漸深入，有臨床觀察顯示烏梅丸可明顯改善結(jié)腸癌患者腹瀉、便秘等癥狀，也有研究人員利用烏梅丸治療胰腺癌后臨床獲益理想，生存期得到延長(zhǎng)[4]，認(rèn)為烏梅丸對(duì)消化道腫瘤的臨床療效值得肯定。本研究探討烏梅丸治療消化道惡性腫瘤的作用機(jī)制是否是通過(guò)Mnt信號(hào)通路進(jìn)行橋接。我們制備結(jié)腸癌動(dòng)物模型，利用烏梅丸進(jìn)行干預(yù)，通過(guò)Western blotting及PCR法對(duì)Mnt信號(hào)通路上的標(biāo)志蛋白進(jìn)行檢測(cè)，探析烏梅丸治療結(jié)腸癌的作用機(jī)制。

1材料與方法

11材料

111動(dòng)物

選取SPF級(jí)昆明雄性小鼠30只，體重18～24 g，平均體重（1726±152）g，鼠齡2～4個(gè)月，平均鼠齡（248±036）個(gè)月，由本院附屬中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，并在該動(dòng)物中心SPF級(jí)飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度23～25 ℃，平均飼養(yǎng)溫度（1441±141）℃。將30只小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組及烏梅丸組，每組10只。3組小鼠在體重、鼠齡等一般情況比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>005），具有可比性。

112藥物

加味烏梅丸，藥物組成：烏梅50 g、當(dāng)歸20 g、細(xì)辛3 g、川椒6 g、桂枝10 g、黃連3 g、黃柏10 g、黨參10 g、干姜10 g、制附片10 g、白芍30 g、生黃芪30 g、炒枳殼10 g、木香10 g。上述中藥飲品購(gòu)自北京華邈中藥工程技術(shù)開發(fā)中心，本院藥劑科制備，常規(guī)水煎煮后用水浴濃縮并置于4 ℃環(huán)境保存?zhèn)溆谩?/p>

113試劑與儀器

10%水合氯醛（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所），SDSPAGE電泳膠（北京碧云天生物技術(shù)研究所），Trizol（美國(guó)Invitrogen公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Promega公司），-actin、Wnt、JNK一抗和堿性磷酸酶標(biāo)記山羊抗兔（美國(guó)CST公司），PCR引物（上海生工生物工程有限公司），BCA蛋白定量試劑盒、SDSPAGE凝膠配制試劑盒、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（北京碧云天生物技術(shù)研究所），聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（美國(guó)Millipore公司），RPMI1640完全培養(yǎng)液（美國(guó)Hyclone公司），BALB/c小鼠來(lái)源的CT26細(xì)胞株（韓國(guó)he Korean Cell Line Bank）。

12方法

121分組與模型制備

將購(gòu)買的CT26細(xì)胞于RPMI1640完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)并調(diào)整密度為2×103 μ/L，后將CT26細(xì)胞注射于小鼠右前腋下部位。空白組小鼠不接受模型制備，當(dāng)小鼠腫瘤直徑4～5 mm時(shí)隨機(jī)分為模型組及烏梅丸組，每組10只[5]。

122干預(yù)方法

烏梅丸組小鼠予10 mg/（kg·d）烏梅丸湯劑進(jìn)行灌胃，1次/d。空白組及模型組小鼠接受相同劑量生理鹽水進(jìn)行灌胃，連續(xù)灌胃28 d。

123檢測(cè)指標(biāo)與方法

1）腫瘤體積、體重及存活率的變化：注射前、注射后每隔3 d測(cè)量一次腫瘤體積，利用游標(biāo)尺作為測(cè)量工具，以（長(zhǎng)×寬2）×2視為腫瘤體積計(jì)算公式。小鼠的體重變化率=（當(dāng)前質(zhì)量-初始質(zhì)量）×100%。存活率=（當(dāng)前小鼠數(shù)量/初始小鼠數(shù)量）×100%。

2）Western blotting檢測(cè)腫瘤組織Wnt、JNK的蛋白水平：每組隨機(jī)選擇3只小鼠脫頸處死后，剪取腫瘤組織100 mg置于離心管中，空白組小鼠取相同部位組織相同質(zhì)量進(jìn)行觀察，根據(jù)不同組織質(zhì)量加入相應(yīng)的裂解液，放置于4 ℃進(jìn)行勻漿處理后設(shè)置15 000 r/min轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心，用移液槍抽吸上清液，使用BCA試劑盒對(duì)25 μL上清液進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定，同時(shí)計(jì)算上樣量。完成上述步驟后以4∶1的比例往上清液中樣緩沖液，將混合液置于100 ℃金屬浴鍋中進(jìn)行蛋白變性7 min。根據(jù)碧云天BCA試劑盒說(shuō)明書配制膠體（6%濃縮膠，12%分離膠），將事先計(jì)算好每組上樣量將標(biāo)本加入膠體中60 V進(jìn)行電145 min后將膠體上的蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜中，再用麗春紅進(jìn)行PVDF膜染色觀察蛋白是否順利轉(zhuǎn)印至PVDF膜中。用TBST將脫脂奶粉配制成5%濃度，將轉(zhuǎn)印后目的蛋白的PVDF膜進(jìn)行封閉2 h，隨后用TBST進(jìn)行洗滌3次，1 min/次。將PCDF膜置于化學(xué)發(fā)光成像儀上，滴入ECL發(fā)光液顯影，隨后進(jìn)行數(shù)據(jù)讀取。

3）PCR法檢測(cè)腫瘤組織Wnt、JNK的mRNA水平變化：每組隨機(jī)選擇3只小鼠脫頸處死后，剪取腫瘤組織100 mg置于離心管中，加用液氮后研磨成碎塊，加入1 mLTrizol充分反應(yīng)后按照說(shuō)明書進(jìn)行總RNA的提取，并測(cè)定總RNA水平，利用PTRNA兩步法的操作說(shuō)明將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以該cDNA為擴(kuò)增模板進(jìn)行Wnt、JNK、GAPDH指標(biāo)的擴(kuò)增。轉(zhuǎn)錄過(guò)程：5 ℃（6 min）-55 ℃（90 s）-72 ℃（90 s）-72 ℃（10 min）-5 ℃（1 h）。具體引物序列參見表1。

13統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 90統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。其中呈正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2組比較用t檢驗(yàn)，多組采用多因素方差分析，以P<005為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

212組腫瘤體積比較

模型組與烏梅丸組小鼠腫瘤體積較干預(yù)前均有增加的趨勢(shì)，其中烏梅丸組增加的速度較慢，并在干預(yù)28 d后腫瘤組織有減小的趨勢(shì)。見表2。

223組小鼠體重比較

干預(yù)28 d空白組小鼠體重與初始體重相近，模型組及烏梅丸組小鼠體重明顯下降，其中模型組較烏梅丸組下降明顯（P<005）。見表3。

233組存活率比較

干預(yù)結(jié)束后空白組所有小鼠均存活，模型組僅有4只小鼠存活，存活率40%，而烏梅丸組有7只小鼠存活，存活率70%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=324，P<005）。

243組大鼠Wnt、JNK蛋白比較

模型組及烏梅丸組小鼠腫瘤組織Wnt、JNK蛋白及mRNA均出現(xiàn)過(guò)表達(dá)，其中模型組Wnt、JNK表達(dá)水平明顯高于烏梅丸組（P<005）。見圖1、圖2。

3討論

結(jié)腸癌最為臨床常見的惡性消化道腫瘤，結(jié)腸癌在我國(guó)的發(fā)病率逐年上升，且發(fā)病年齡呈年輕化趨勢(shì)，其中位發(fā)病年齡較歐美國(guó)家提前了近10年之多，這一數(shù)據(jù)引起了我國(guó)相關(guān)醫(yī)務(wù)工作者及科研人員的廣泛關(guān)注[6]。隨著結(jié)腸鏡在臨床的普遍使用，結(jié)腸癌的發(fā)現(xiàn)率較前遠(yuǎn)遠(yuǎn)提高，但其死亡率仍遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他種類的腫瘤，其中轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌雖然在一定時(shí)間段內(nèi)可進(jìn)行切除治療，但是術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移仍是治療失敗的主要原因。目前多數(shù)抗癌藥物主要是延緩腫瘤的生長(zhǎng)，無(wú)法抑制其增長(zhǎng)，當(dāng)腫瘤體積逐漸增大導(dǎo)致腸道梗阻后臨床多數(shù)無(wú)更為有效的辦法，最終導(dǎo)致患者死亡。有研究人員曾經(jīng)利用腸管內(nèi)支架植入以期緩解腸道局部梗阻，但此方法將影響腸道蠕動(dòng)，難以達(dá)到治療期望值。因此，探索新的有效的臨床方法，減輕結(jié)腸癌的病情，延長(zhǎng)患者生存時(shí)間是目前臨床探索的需求。

烏梅丸源自醫(yī)圣張仲景之《傷寒論·辨厥陰病脈證并治》，主要用于治療蛔厥證，書中認(rèn)為“厥陰之為病，消渴，氣上撞心，心中疼熱，饑而不欲食，食則吐蟯。下之利不止”，而結(jié)腸癌存在的腹脹、消化不良、腹痛、乏力、消瘦均與蛔厥證的臨床表現(xiàn)符合，故使用烏梅丸治療結(jié)腸癌具有一定的理論依據(jù)。本研究在清上熱溫下寒的烏梅丸基礎(chǔ)上加用白芍、生黃芪、炒枳殼、木香。方中烏梅為君藥，取酸能安蛔之功，腸寒則蛔動(dòng)更甚，腹痛加劇，加川椒、細(xì)辛辛溫伏蛔，并驅(qū)寒溫下；黃連、黃柏苦寒，清解因蛔蟲上擾，氣機(jī)逆亂所致之內(nèi)熱；附子、干姜、桂枝皆為溫?zé)嶂罚稍鰪?qiáng)散寒溫臟之功；當(dāng)歸、黨參補(bǔ)益氣血，白芍與當(dāng)歸合用可斂陰緩中止痛，加黃芪可助黨參益氣生血，枳殼、木香加強(qiáng)理氣以止痛。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為腫瘤的發(fā)生發(fā)展雖病因多樣，但正氣的盛衰是取決于腫瘤轉(zhuǎn)歸的主導(dǎo)因素，正氣盛則機(jī)體可有力抵御病邪，具有正常的自然修復(fù)力。現(xiàn)代藥理證實(shí)黃芪、黨參藥用成分具有極強(qiáng)的抗腫瘤效應(yīng)，桂枝提取物亦在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中被證實(shí)具有抑制癌細(xì)胞增殖的效果[78]。故我們認(rèn)為加味烏梅丸用于結(jié)腸癌有一定的臨床基礎(chǔ)。本研究數(shù)據(jù)顯示，加味烏梅丸不論是在抑制小鼠腫瘤體積方面，還是提高體重及存活率方面均有明顯的優(yōu)勢(shì)，這證實(shí)了加味烏梅丸確有理想的抗腫瘤效果。

在對(duì)其作用機(jī)理進(jìn)一步探討時(shí)我們檢測(cè)了小鼠腫瘤組織Wnt信號(hào)通路的標(biāo)志性因子，Wnt/JNK通路在機(jī)體胚胎階段已參與細(xì)胞骨架的重排過(guò)程，與原腸胚的形成關(guān)系密切[912]。JNK是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，廣泛分布于哺乳動(dòng)物全身組織，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡以及癌基因的轉(zhuǎn)化都有參與調(diào)控[1316]，JNK在多類惡性腫瘤組織中均過(guò)表達(dá)，通過(guò)干擾JNK或沉默JNK基因可明顯減弱癌細(xì)胞的體外遷移及侵襲力，因此抑制JNK的表達(dá)是抑制癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)及侵襲力的靶方向。本研究數(shù)據(jù)顯示，加味烏梅丸可明顯抑制結(jié)腸癌模型小鼠Wnt、JNK表達(dá)，我們認(rèn)為這是加味烏梅丸抗癌的主要機(jī)制之一。此外，本研究利用Western blotting檢測(cè)腫瘤組織相關(guān)蛋白因子的變化，僅僅是半定量觀察，且無(wú)法觀察各因子在細(xì)胞或組織內(nèi)的定位變化，下階段將增加形態(tài)學(xué)的檢查進(jìn)一步研究加味烏梅丸的作用機(jī)制。

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（2017-10-20收稿責(zé)任編輯：楊覺雄）