芪連扶正膠囊干預(yù)肺癌干細(xì)胞白細(xì)胞介素10、轉(zhuǎn)化生長因子β1表達(dá)對(duì)免疫重塑的影響

李慧杰　齊元富　李秀榮

摘要目的：觀察芪連扶正膠囊干預(yù)肺癌干細(xì)胞免疫相關(guān)因子白細(xì)胞介素10（IL10）、轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGFβ1）表達(dá)對(duì)其免疫重塑的影響。方法：選取體外常規(guī)培養(yǎng)肺癌A549細(xì)胞，免疫磁珠法分選干細(xì)胞，制備芪連扶正膠囊含藥血清，按實(shí)驗(yàn)分組干預(yù)，免疫酶聯(lián)吸附試驗(yàn)法檢測各組IL10、TGFβ1的表達(dá)，RTPCR法檢測各組IL10 mRNA、TGFβ1 mRNA的表達(dá)。結(jié)果：對(duì)照組、芪連扶正膠囊組、順鉑組、芪連扶正膠囊+順鉑組的IL10表達(dá)依次為（11903±699）%，（10891±807）%，（9671±578）%，（5641±795）%；TGFβ1表達(dá)依次為（17479±795）%，（16051±803）%，（14128±697）%，（9734±763）%；IL10mRNA表達(dá)依次為（106±019）%，（085±018）%，（067±016）%，（047±012）%；TGFβ1mRNA表達(dá)（127±026）%，（101±020）%，（077±014）%，（050±010）%。結(jié)論：芪連扶正膠囊可降低肺癌干細(xì)胞IL10、TGFβ1表達(dá)，改善細(xì)胞免疫抑制狀態(tài)，調(diào)節(jié)免疫重塑，進(jìn)而抑制肺癌轉(zhuǎn)移。

關(guān)鍵詞芪連扶正膠囊；肺癌；干細(xì)胞；腫瘤轉(zhuǎn)移；免疫重塑；免疫逃逸；白細(xì)胞介素10；轉(zhuǎn)化生長因子β1

Effects of Qilian Fuzheng Capsule on the Immune Remodeling by Interfering with the Expression of IL10 and TGFBeta 1 in Lung Cancer Stem Cells

Li Huijie，Qi Yuanfu，Li Xiurong，Zhang Yingying

（The Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250014，China）

AbstractObjective：To observe the effects of Qilian Fuzheng Capsule on the immune remodeling by interfering with the expression of IL10 and TGFβ1 in lung cancer stem cells.Methods：We cultured the lung cancer A549 cells in vitro，sorted the stem cells by immunomagnetic beads，and prepared the serum containing of Qilian Fuzheng Capsule.According to the experimental group intervention，the expression of IL10 and TGFβ1 in each group was detected by Elisa，and the expressions of IL10mRNA，TGFand 1mRNA in each group were detected by RTPCR.Results：In the control group，Qilian Fuzheng Capsule group，cisplatin group，Qilian Fuzheng capsule+cisplatin group，IL10 expression levels were （11903±699）%，（10891±807）%，（9671±578）%，（5641±795）%； TGFβ1 expression levels were （17479±795）%，（16051±803）%，（14128±697）%，（9734±763）%； IL10mRNA expression levels were （106±019）%，（085±018）%，（067±016）%，（047±012）%； TGFβ1mRNA expression levels were （127±026）%，（101±020）%，（077±014）%，（050±010）%.Conclusion：Qilian Fuzheng Capsule can reduce the expression of IL10 and TGFβ1 in lung cancer stem cells，improve the cellular immune suppression status，regulate immune remodeling and inhibit lung cancer metastasis.

Key WordsQilian Fuzheng Capsule； Lung cancer； Stem cell； Tumor metastasis； Immune remodeling； Immune evasion； IL10； TGFβ1

中圖分類號(hào)：R273；R2895文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.08.037

腫瘤干細(xì)胞是腫瘤組織中存在的小部分具有自我更新能力和分化潛能的細(xì)胞，是腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的根源[1]。腫瘤轉(zhuǎn)移過程中存在免疫逃逸現(xiàn)象，而免疫重塑是最終導(dǎo)致逃逸的關(guān)鍵[2]。免疫重塑的腫瘤細(xì)胞能過度產(chǎn)生抑制性細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素10（IL10），轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGFβ1）等，并誘導(dǎo)產(chǎn)生調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、抑制性巨噬細(xì)胞，在腫瘤局部形成免疫抑制的腫瘤微環(huán)境[3]。中醫(yī)藥在改善機(jī)體免疫功能、提高患者生命質(zhì)量方面彰顯優(yōu)勢，本研究觀察芪連扶正膠囊對(duì)肺癌干細(xì)胞免疫相關(guān)因子IL10、TGFβ1表達(dá)的影響，探討其對(duì)肺癌干細(xì)胞免疫重塑的影響，以期為抑制肺癌轉(zhuǎn)移及肺癌治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

11材料

111細(xì)胞與動(dòng)物細(xì)胞為山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)的人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞株。動(dòng)物為SPF級(jí)體重±200 g、雄性SD大鼠，購買于濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司（質(zhì)量合格證號(hào)SCXK（魯）20140007），飼養(yǎng)于山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室SPF動(dòng)物房。

112主要藥物芪連扶正膠囊（山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，批號(hào)Z01080226），注射用順鉑（齊魯制藥有限公司，批號(hào)H20023461）。

113試劑與儀器

主要試劑：RPMI1640培養(yǎng)基及胎牛血清（天津市灝洋生物制品科技有限公司）、免疫酶聯(lián)吸附試驗(yàn)法（ELISA）檢測試劑盒（南京巴傲得生物科技有限公司）、CD133細(xì)胞分離試劑盒、PE標(biāo)記的CD133抗體（美國Gene Copoeia公司）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司）、RNA引物（生工生物工程股份有限公司，IL10上游5′TTACCTGGAGGTGATGC3′、下游5′GGGAAGAAATCGATGACAGC3′；TGFβ1：上游5′GTACCTGAACCCGTGTTGCT3′，下游5′GTATCGCAGGAATTGTTGC3′；GAPDH上游5′AGAAGGCTGGGGCTCATTTG3′，下游5′AGGGGCCATCCACAGTCTTC3′）。

主要儀器：ClassⅡ2085型超凈工作臺(tái)、Multiskan Go酶標(biāo)儀（美國Thermo Forma公司），BB5060UV型CO2培養(yǎng)箱（德國Heraeus公司），Axiovert 40型倒置相差顯微鏡（德國蔡司），流式細(xì)胞儀（美國Becton Dickinson公司），TransBlot Turbo轉(zhuǎn)膜儀、電泳系統(tǒng)（美國Biorad公司），Innotech Fluor Chem Q成像分析系統(tǒng)（美國Alpha公司），96孔型PCR儀（美國Therm Fisher公司），LightCycler 480Ⅱ?qū)崟r(shí)熒光定量PCR儀（美國ROCHE公司）。

12方法

121分組與模型制備

實(shí)驗(yàn)分組：分為對(duì)照組（10%胎牛血清）、芪連扶正膠囊組（芪連扶正膠囊含藥血清）、順鉑組（終濃度為2 μg/mL的順鉑溶液）、聯(lián)合組（芪連扶正膠囊含藥血清+順鉑溶液）。

含藥血清制備：購買體重±200 g的雄性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d；隨機(jī)分為芪連扶正膠囊組及對(duì)照組，芪連扶正膠囊組大鼠灌胃應(yīng)用芪連扶正膠囊溶液，對(duì)照組應(yīng)用等量生理鹽水，灌胃1次/d、連續(xù)灌14 d；末次灌胃前12 h禁食，末次灌胃后1 h 10%水合氯醛麻醉大鼠；經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，離心取血清，022 μm微孔濾膜過濾，保存于-80 ℃冰箱備用。

肺癌干細(xì)胞分選：常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞，消化離心收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度、清洗、加入、緩沖液重懸細(xì)胞，按照CD133細(xì)胞分離試劑盒說明逐步進(jìn)行，流式細(xì)胞儀檢測陽性細(xì)胞的百分率，分選的CD133+比例為8079%，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

122干預(yù)方法

肺癌干細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長到80%左右，按實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行干預(yù)，48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測定。

123檢測指標(biāo)與方法

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測IL10、TGFβ1：常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞，按實(shí)驗(yàn)分組干預(yù)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，離心收集，保存于-80 ℃冰箱備用；檢測時(shí)，配制標(biāo)準(zhǔn)品，加樣，封板溫育30 min，洗板，加酶標(biāo)試劑，重復(fù)后加顯色劑，震蕩混勻，避光顯色15 min，加終止液，酶標(biāo)儀450 nm波長下測定各孔吸光度值（A值），計(jì)算數(shù)據(jù)。

RTPCR法檢測IL10mRNA、TGFβ1mRNA：常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞，按實(shí)驗(yàn)分組加藥，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，逐步提取總RNA，測定RNA濃度，標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)；逐步合成cDNA，PCR擴(kuò)增，上機(jī)檢測，根據(jù)公式2-△△CT處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

13統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 190統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析，以P<005為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

21肺癌干細(xì)胞IL10、TGFβ1表達(dá)情況

與對(duì)照組比較，各藥組均可降低細(xì)胞IL10和TGFβ1的表達(dá)（P<005）；與順鉑組比較，芪連扶正膠囊組及聯(lián)合組的IL10和TGFβ1表達(dá)均與之差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005）。見表1。

22肺癌干細(xì)胞IL10mRNA、TGFβ1mRNA表達(dá)

與對(duì)照組比較，各用藥組均可降低細(xì)胞IL10mRNA、TGFβ1mRNA表達(dá)（P<005）；與順鉑組比較，芪連扶正膠囊組IL10mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>005）、而聯(lián)合組較之差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005），TGFβ1mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005）。見表2。

3討論

腫瘤干細(xì)胞是存在于肺癌細(xì)胞中的一個(gè)亞群，具有高度自我更新及無限增殖能力，研究證實(shí)其與腫瘤發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)密切相關(guān)[4]，是肺癌惡性表型的根源和潛在的治療靶點(diǎn)，肺癌也不例外[5]。腫瘤的發(fā)生發(fā)展涉及到腫瘤細(xì)胞與機(jī)體免疫系統(tǒng)相互作用的復(fù)雜過程，當(dāng)機(jī)體發(fā)生腫瘤時(shí)，腫瘤細(xì)胞可使自身不被免疫效應(yīng)細(xì)胞殺傷即免疫逃逸[6]，加之其分泌免疫抑制因子可改變腫瘤抑制的微環(huán)境、介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞逃避免疫系統(tǒng)攻擊，促進(jìn)腫瘤發(fā)生與生長[7]。且機(jī)體免疫系統(tǒng)具有抗腫瘤的保護(hù)功能，以及對(duì)腫瘤的重新塑型功能，我們將后者稱之“免疫重塑”，即免疫系統(tǒng)不斷殺傷較高免疫原性的腫瘤細(xì)胞，同時(shí)忽略低免疫原性的腫瘤細(xì)胞，逐漸出現(xiàn)免疫原性更低、惡性程度更高的腫瘤表型，并在體內(nèi)存留下來的過程[8]。免疫重塑不但可以影響機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤進(jìn)行重塑與編輯，亦可改變機(jī)體免疫系統(tǒng)相關(guān)成分，從而更利于腫瘤免疫逃逸的形成，以及腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移。免疫重塑的腫瘤細(xì)胞能產(chǎn)生大量抑制性細(xì)胞因子，如IL10、TGFβ1等，其通過直接接觸及誘導(dǎo)該類因子削弱細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（Cytotoxic Lymphocyte，CTL）、自然殺傷細(xì)胞的殺傷活性，進(jìn)而逃逸機(jī)體免疫監(jiān)視，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[910]。其中，IL10是參與腫瘤免疫逃逸的重要免疫抑制因子，具有雙向免疫調(diào)節(jié)特性，其介導(dǎo)免疫抑制機(jī)制是通過作用于不同免疫細(xì)胞亞群多途徑發(fā)揮免疫抑制，促進(jìn)機(jī)體抗腫瘤免疫逃逸[11]。而TGFβ1可直接或間接作用于免疫細(xì)胞，誘導(dǎo)其功能缺失，幫助腫瘤逃避機(jī)體免疫監(jiān)視功能，促進(jìn)腫瘤發(fā)展[12]；另外，TGFβ1可促進(jìn)腫瘤組織血管生成、加速腫瘤細(xì)胞和外基質(zhì)之間相互作用，抑制機(jī)體免疫，加速腫瘤生長及浸潤轉(zhuǎn)移[13]。有研究證實(shí)IL10、TGFβ1參與肺癌患者腫瘤微環(huán)境構(gòu)成，是肺癌患者免疫應(yīng)答受到抑制的原因之一，促進(jìn)了肺癌的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移，并強(qiáng)調(diào)兩者可作為監(jiān)控肺癌患者免疫功能的參考指標(biāo)[14]。

芪連扶正膠囊是我院研發(fā)的抗腫瘤自制劑，前期臨床研究觀察了芪連扶正膠囊對(duì)化療患者免疫功能的影響，結(jié)果顯示：芪連扶正膠囊組提高白細(xì)胞及中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯，有效率高達(dá)9429%，T淋巴細(xì)胞亞群及自然殺傷細(xì)胞活性亦較對(duì)照組改善明顯，可保護(hù)機(jī)體免疫功能[15]；芪連扶正膠囊聯(lián)合化療治療晚期非小細(xì)胞肺癌可改善患者大部分臨床癥狀，提高生命質(zhì)量，保護(hù)機(jī)體免疫功能，降低腫瘤標(biāo)志物CEA與CA125水平，減輕血液和消化道不良反應(yīng)，具有增效減毒作用[16]；其維持治療晚期非小細(xì)胞肺癌的具有可行性，可延長患者無疾病進(jìn)展生存期[17]。實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)芪連扶正膠囊可增加荷瘤小鼠的免疫器官質(zhì)量，改善小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能，提高荷瘤小鼠的自然殺傷細(xì)胞活性；芪連扶正膠囊可提高細(xì)胞表面共刺激分子B71、B72的表達(dá)，促進(jìn)T細(xì)胞活化，增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能[18]；芪連扶正膠囊可通過調(diào)控TGFβ1抑制肺癌A549細(xì)胞增殖侵襲及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生。前期研究從不同角度證實(shí)芪連扶正膠囊具有提高機(jī)體免疫力、抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移作用，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。本研究觀察了芪連扶正膠囊含藥血清對(duì)肺癌干細(xì)胞免疫相關(guān)因子IL10、TGFβ1表達(dá)的影響，結(jié)果顯示芪連扶正膠囊可降低IL10、TGFβ1的蛋白及基因表達(dá)，與對(duì)照組比較有顯著性差異，降低程度雖不及順鉑，但與順鉑有協(xié)同作用。

綜上所述，肺癌干細(xì)胞是肺癌轉(zhuǎn)移的根源，免疫重塑加速肺癌轉(zhuǎn)移，IL10、TGFβ1是免疫逃逸的重要分子，在免疫重塑過程中發(fā)揮重要作用，而芪連扶正膠囊可通過降低IL10、TGFβ1表達(dá)改善細(xì)胞免疫抑制狀態(tài)，進(jìn)而發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫重塑、抑制肺癌轉(zhuǎn)移的作用?；诖耍M(jìn)一步探尋中醫(yī)藥免疫治療靶點(diǎn)可為抑制肺癌轉(zhuǎn)移及肺癌綜合治療提供新策略。

參考文獻(xiàn)

[1]Gazdic M，Simovic Markovic B，Jovicic N，et al.Mesenchymal Stem Cells Promote Metastasis of Lung Cancer Cells by Downregulating Systemic Antitumor Immune Response[J].Stem Cells Int，2017，2017：6294717.

[2]Guo Q，Jin Z，Yuan Y，et al.New mechanisms of tumorassociated macrophages on promoting tumor progression：recent research advances and potential targets for tumor immunotherapy[J].J Immunol Res，2016，2016：9720912.Epub 2016 Nov 16.

[3]劉瑞，張玉人，李杰.腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的免疫重塑—中藥抗腫瘤治療的新靶點(diǎn)[J].腫瘤防治研究，2012，39（4）：470473.

[4]Albini A，Bruno A，Gallo C，et al.Cancer stem cells and the tumor microenvironment：interplay in tumor heterogeneity[J].Connect Tissue Res，2015，56（5）：414425.

[5]Aoi T.Biology of lung cancer：genetic mutation，epithelialmesenchymal transition，and cancer stem cells[J].Gen Thorac Cardiovasc Surg，2016，64（9）：517523.

[6]Millrud CR，Bergenfelz C，Leandersson K.On the origin of myeloidderived suppressor cells[J].Oncotarget，2017，8（2）：36493665.

[7]張錦鵬，李瑞超，高軒，等.腫瘤免疫逃逸機(jī)制的研究進(jìn)展[J].生命的化學(xué)，2017，37（3）：367372.

[8]薛娜，林洪生.免疫編輯理論與中醫(yī)藥抗腫瘤免疫[J].中醫(yī)雜志，2012，53（21）：18011804.

[9]Solinas G，Schiarea S，Liguori M，et al.Tumorconditioned macrophages secrete migrationstimulating factor：a new marker for M2polarization，influencing tumor cell motility[J].J Immunol，2010，185（1）：642652.

[10]Wei J，Barr J，Kong LY，et al.Glioblastoma cancerinitiating cells inhibit Tcell proliferation and effector responses by the signal transducers and activators of transcription 3 pathway[J].Mol Cancer Ther，2010，9（1）：6778.

[11]王佳麗，劉麗華.IL10對(duì)腫瘤免疫雙向調(diào)節(jié)的研究進(jìn)展[J].中國腫瘤生物治療雜志，2016，23（1）：130133.

[12]Bellomo C，Caja L，Moustakas A.Transforming growth factor β as regulator of cancer stemness and metastasis[J].Br J Cancer，2016，115（7）：761769.

[13]王濤，張澤峰，高峰，等.肺癌患者血清TGFβ1水平變化及其與臨床特征的關(guān)系[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2016，16（30）：59115913，5936.

[14]梁晶.肺癌患者外周血Treg細(xì)胞與IL10、TGFβ檢測及其臨床意義[J].臨床肺科雜志，2015，20（11）：19801983.

[15]李慧杰，孟雙榮，李秀榮.芪連扶正膠囊對(duì)化療患者免疫功能的影響[J].河南中醫(yī)，2009，29（6）：561562.

[16]李慧杰.芪連扶正膠囊聯(lián)合GP方案治療晚期非小細(xì)胞肺癌的臨床研究[D].濟(jì)南：山東中醫(yī)藥大學(xué)，2010：612.

[17]李慧杰，齊元富，李秀榮.芪連扶正膠囊維持治療晚期非小細(xì)胞肺癌優(yōu)勢分析[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2014，21（3）：2123.

[18]李秀榮，張盈盈，李慧杰，等.芪連扶正膠囊對(duì)乳腺癌MCF7細(xì)胞增殖及B7CD28共刺激通路的影響[J].山東中醫(yī)雜志，2016，35（4）：344346.

（2017-10-29收稿責(zé)任編輯：楊覺雄）